Osawa, Masanori

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Affiliation

Faculty of Pharmacy, Department of Pharmaceutical Sciences Division of Physics for Life Functions (Shiba-Kyoritsu)

Position

Professor

 

Research Areas 【 Display / hide

  • Structural biochemistry

  • Biophysics

Research Keywords 【 Display / hide

  • ion channel

  • Signal transduction

  • nuclear magnetic resonance

  • structural biology

  • translation factor

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Books 【 Display / hide

  • Nuclear magnetic resonance approaches for characterizing protein-protein interactions

    Toyama Y, Mase Y, Kano H, Yokogawa M, Osawa M, Shimada I, Methods in Molecular Biology, 2018

     View Summary

    The gating of potassium ion (K+) channels is regulated by various kinds of protein-protein interactions (PPIs). Structural investigations of these PPIs provide useful information not only for understanding the gating mechanisms of K+ channels, but also for developing the pharmaceutical compounds targeting K+ channels. Here, we describe a nuclear magnetic resonance spectroscopic method, termed the cross saturation (CS) method, to accurately determine the binding surfaces of protein complexes, and its application to the investigation of the interaction between a G protein-coupled inwardly rectifying K+ channel and a G protein α subunit.

  • 【試料分析講座】「蛋白質の分析」

    OSAWA MASANORI, 分析化学会(丸善), 2012

    Scope: NMR・CDスペクトル

  • 分子細胞生物学辞典 (第2版)

    OSAWA MASANORI, 東京化学同人, 2008

    Scope: 「等温滴定型カロリメトリー」,「滴定曲線」

  • 実験医学別冊「生命科学のための機器分析実験ハンドブック」

    OSAWA MASANORI, 羊土社, 2007

    Scope: 「等温滴定型カロリメトリー(ITC) ~熱量測定による相互作用の定量的解析~」

  • 「物理系薬学」 III. 生体分子・化学物質の構造決定

    OSAWA MASANORI, 東京化学同人, 2005

    Scope: 「SBO15 タンパク質の自由度について概説できる」

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Papers 【 Display / hide

  • Identification of novel inhibitors of Keap1/Nrf2 by a promising method combining protein–protein interaction-oriented library and machine learning

    Shimizu Y, Yonezawa T, Sakamoto J, Furuya T, Osawa M, Ikeda K

    Scientific Reports (Scientific Reports)  11 ( 1 ) 7420 2021.12

    Joint Work, Except for reviews

     View Summary

    Protein–protein interactions (PPIs) are prospective but challenging targets for drug discovery, because screening using traditional small-molecule libraries often fails to identify hits. Recently, we developed a PPI-oriented library comprising 12,593 small-to-medium-sized newly synthesized molecules. This study validates a promising combined method using PPI-oriented library and ligand-based virtual screening (LBVS) to discover novel PPI inhibitory compounds for Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). We performed LBVS with two random forest models against our PPI library and the following time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) assays of 620 compounds identified 15 specific hit compounds. The high hit rates for the entire PPI library (estimated 0.56–1.3%) and the LBVS (maximum 5.4%) compared to a conventional screening library showed the utility of the library and the efficiency of LBVS. All the hit compounds possessed novel structures with Tanimoto similarity ≤ 0.26 to known Keap1/Nrf2 inhibitors and aqueous solubility (AlogP < 5). Reasonable binding modes were predicted using 3D alignment of five hit compounds and a Keap1/Nrf2 peptide crystal structure. Our results represent a new, efficient method combining the PPI library and LBVS to identify novel PPI inhibitory ligands with expanded chemical space.

  • Comprehensive Approach of <sup>19</sup>F Nuclear Magnetic Resonance, Enzymatic, and <i>In Silico</i> Methods for Site-Specific Hit Selection and Validation of Fragment Molecules that Inhibit Methionine γ-Lyase Activity.

    Ikeda K, Kezuka Y, Nonaka T, Yonezawa T, Osawa M, Katoh E

    Journal of medicinal chemistry  2021.09

    ISSN  0022-2623

  • Peptide Toxins Targeting KV Channels

    Matsumura K., Yokogawa M., Osawa M.

    Handb. Exp. Pharmacol. (Springer Nature)  267   481 - 505 2021.06

    Research paper (scientific journal), Joint Work, Accepted,  ISSN  0171-2004

     View Summary

    A number of peptide toxins isolated from animals target potassium ion (K+) channels. Many of them are particularly known to inhibit voltage-gated K+ (KV) channels and are mainly classified into pore-blocking toxins or gating-modifier toxins. Pore-blocking toxins directly bind to the ion permeation pores of KV channels, thereby physically occluding them. In contrast, gating-modifier toxins bind to the voltage-sensor domains of KV channels, modulating their voltage-dependent conformational changes. These peptide toxins are useful molecular tools in revealing the structure-function relationship of KV channels and have potential for novel treatments for diseases related to KV channels. This review focuses on the inhibition mechanism of pore-blocking and gating-modifier toxins that target KV channels.

  • Mechanism of hERG inhibition by gating-modifier toxin, APETx1, deduced by functional characterization

    Matsumura K., Shimomura T., Kubo Y., Oka T., Kobayashi N., Imai S., Yanase N., Akimoto M., Fukuda M., Yokogawa M., Ikeda K., Kurita J.i., Nishimura Y., Shimada I., Osawa M.

    BMC Molecular and Cell Biology (BMC Molecular and Cell Biology)  22 ( 1 ) 3 2021.01

    Research paper (scientific journal), Joint Work, Accepted

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    Background: Human ether-à-go-go-related gene potassium channel 1 (hERG) is a voltage-gated potassium channel, the voltage-sensing domain (VSD) of which is targeted by a gating-modifier toxin, APETx1. APETx1 is a 42-residue peptide toxin of sea anemone Anthopleura elegantissima and inhibits hERG by stabilizing the resting state. A previous study that conducted cysteine-scanning analysis of hERG identified two residues in the S3-S4 region of the VSD that play important roles in hERG inhibition by APETx1. However, mutational analysis of APETx1 could not be conducted as only natural resources have been available until now. Therefore, it remains unclear where and how APETx1 interacts with the VSD in the resting state. Results: We established a method for preparing recombinant APETx1 and determined the NMR structure of the recombinant APETx1, which is structurally equivalent to the natural product. Electrophysiological analyses using wild type and mutants of APETx1 and hERG revealed that their hydrophobic residues, F15, Y32, F33, and L34, in APETx1, and F508 and I521 in hERG, in addition to a previously reported acidic hERG residue, E518, play key roles in the inhibition of hERG by APETx1. Our hypothetical docking models of the APETx1-VSD complex satisfied the results of mutational analysis. Conclusions: The present study identified the key residues of APETx1 and hERG that are involved in hERG inhibition by APETx1. These results would help advance understanding of the inhibitory mechanism of APETx1, which could provide a structural basis for designing novel ligands targeting the VSDs of KV channels.

  • Conformational equilibrium shift underlies altered K<sup>+</sup> channel gating as revealed by NMR

    Iwahashi Y., Toyama Y., Imai S., Itoh H., Osawa M., Inoue M., Shimada I.

    Nature Communications (Springer Nature )  11 ( 1 )  2020.12

    Research paper (scientific journal), Joint Work, Accepted

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    The potassium ion (K+) channel plays a fundamental role in controlling K+ permeation across the cell membrane and regulating cellular excitabilities. Mutations in the transmembrane pore reportedly affect the gating transitions of K+ channels, and are associated with the onset of neural disorders. However, due to the lack of structural and dynamic insights into the functions of K+ channels, the structural mechanism by which these mutations cause K+ channel dysfunctions remains elusive. Here, we used nuclear magnetic resonance spectroscopy to investigate the structural mechanism underlying the decreased K+-permeation caused by disease-related mutations, using the prokaryotic K+ channel KcsA. We demonstrated that the conformational equilibrium in the transmembrane region is shifted toward the non-conductive state with the closed intracellular K+-gate in the disease-related mutant. We also demonstrated that this equilibrium shift is attributable to the additional steric contacts in the open-conductive structure, which are evoked by the increased side-chain bulkiness of the residues lining the transmembrane helix. Our results suggest that the alteration in the conformational equilibrium of the intracellular K+-gate is one of the fundamental mechanisms underlying the dysfunctions of K+ channels caused by disease-related mutations.

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Papers, etc., Registered in KOARA 【 Display / hide

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  • Mechanism of hERG inhibition by gating-modifier toxin, APETx1, deduced by functional characterization.

    BMC molecular and cell biology  2021.01

     View Summary

    <h4>Background</h4>Human ether-à-go-go-related gene potassium channel 1 (hERG) is a voltage-gated potassium channel, the voltage-sensing domain (VSD) of which is targeted by a gating-modifier toxin, APETx1. APETx1 is a 42-residue peptide toxin of sea anemone Anthopleura elegantissima and inhibits hERG by stabilizing the resting state. A previous study that conducted cysteine-scanning analysis of hERG identified two residues in the S3-S4 region of the VSD that play important roles in hERG inhibition by APETx1. However, mutational analysis of APETx1 could not be conducted as only natural resources have been available until now. Therefore, it remains unclear where and how APETx1 interacts with the VSD in the resting state.<h4>Results</h4>We established a method for preparing recombinant APETx1 and determined the NMR structure of the recombinant APETx1, which is structurally equivalent to the natural product. Electrophysiological analyses using wild type and mutants of APETx1 and hERG revealed that their hydrophobic residues, F15, Y32, F33, and L34, in APETx1, and F508 and I521 in hERG, in addition to a previously reported acidic hERG residue, E518, play key roles in the inhibition of hERG by APETx1. Our hypothetical docking models of the APETx1-VSD complex satisfied the results of mutational analysis.<h4>Conclusions</h4>The present study identified the key residues of APETx1 and hERG that are involved in hERG inhibition by APETx1. These results would help advance understanding of the inhibitory mechanism of APETx1, which could provide a structural basis for designing novel ligands targeting the VSDs of K<sub>V</sub> channels.

  • Functional roles of Mg2+ binding sites in ion-dependent gating of a Mg2+ channel, MgtE, revealed by solution NMR

    Tatsuro Maruyama and Shunsuke Imai and Tsukasa Kusakizako and Motoyuki Hattori and Ryuichiro Ishitani and Osamu Nureki and Koichi Ito and Andr{\`{e}}s D Maturana and Ichio Shimada and Masanori Osawa

    eLife ({eLife} Sciences Organisation, Ltd.)  7 2018.04

Presentations 【 Display / hide

  • 電位依存性K+チャネルの動作メカニズムとペプチドによる阻害メカニズム

    大澤匡範

    第28回日本血液代替物学会年次大会, 2021.10, Oral Presentation(guest/special)

  • Gating-modifier toxin APETx1による電位依存性カリウムイオンチャネルhERG阻害機構の解析

    大澤匡範

    BINDS-PDBj講習会「PDBから見てわかるタンパク質の最新研究」, 2021.09, Oral Presentation(guest/special)

  • Gating-modifier toxin APETx1による電位依存性カリウムイオンチャネルhERG阻害機構の解析

    大澤匡範

    生理学研究所研究会「構造情報を基盤とした膜機能分子の生理機能理解に向けて」, 2021.09, Oral Presentation(guest/special)

  • Structural Mechanism of Translational Repression by PABP-interacting protein 2

    Takeru Sagae, Mariko Yokogawa, Ryoichi Sawazaki, Nao Hisoda, Shin-ichi Hoshino, Masanori Osawa

    ISMAR-APNMR-NMRSJ-SEST 2021 (Osaka, Japan (online)) , 2021.08, Poster (general), ISMAR-APNMR-NMRSJ-SEST

  • Mechanism of hERG inhibition by gating-modifier toxin, APETx1, deduced by functional characterization

    松村一輝、下村拓史、久保義弘、岡貴之、小林直宏、今井駿輔、簗瀬尚美、秋元まどか、福田昌弘、横川真梨子、池田和由、栗田順一、西村善文、嶋田一夫、大澤匡範

    第21回日本蛋白質科学会年会 (富山(オンライン)) , 2021.06, Poster (general), 日本蛋白質科学会

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Research Projects of Competitive Funds, etc. 【 Display / hide

  • 電位依存性イオンチャネルの機能構造と構造間遷移機構の解析による動作機構解明

    2021.04
    -
    2024.03

    MEXT,JSPS, Grant-in-Aid for Scientific Research, 大澤 匡範, 横川 真梨子, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Principal Investigator

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    電位依存性イオンチャネル(VGIC)は、神経伝達や心臓の拍動を担う膜タンパク質であり、創薬の標的としても重要である。VGICは一般に、膜電位に応じた構造変化によりイオン透過ゲートを開閉し、特定のイオンを膜透過させることで膜電位を制御する。しかしながら、これまではその構造遷移メカニズムは不明であった。
    そこで本研究では、リガンドの結合や化学修飾により未解明である機能構造を安定化して構造解析を実現可能とする手法を確立し、その立体構造をX線結晶構造解析あるいは電子顕微鏡により原子レベルで明らかにするとともに、NMRによりそれらの間の構造遷移を解析することにより、VGICの動作メカニズムを解明する。

  • B型肝炎ウイルスの肝細胞侵入・増殖機構の構造基盤と立体構造に基づく創薬

    2021.04
    -
    2024.03

    Keio University, 横川 真梨子, 大澤 匡範, Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

     View Summary

    B型肝炎ウイルス(HBV) 外殻膜の表面抗原タンパク質(LHBs)は、肝細胞への感染時には肝細胞膜上のタンパク質であるNTCPと結合し、宿主内での増殖時にはHBVのキャプシドを形成するタンパク質であるCpと結合する。そこで本研究は、LHBs―NTCPおよびLHBs―Cpの相互作用様式を原子分解能で明らかにすることで、HBVの肝細胞侵入・増殖メカニズムを解明する。明らかにした立体構造に基づくin silicoスクリーニング、および得られた候補化合物のin vitroアッセイを行うことで、これらのタンパク質-タンパク質相互作用を阻害する中分子合成化合物を探索し、新規作用機序の抗HBV薬を創製する。

  • 14-3-3タンパク質によるリン酸化シグナル経路の熱力学的・構造生物学的基盤

    2019.04
    -
    2021.03

    MEXT,JSPS, Grant-in-Aid for Scientific Research, 大澤 匡範, Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, Principal Investigator

     View Summary

    多くのがん細胞においては、Ras タンパク質の活性化を起源として、その下流にあるキナーゼを活性化し、そのキナーゼは連鎖的に別のキナーゼをリン酸化・活性化する、というリン酸化シグナルが亢進している。そのシグナルを持続させる機能をもつタンパク質が14-3-3タンパク質である。本研究では、この14-3-3タンパク質がいかにしてリン酸化シグナルを持続させるのかを定量的に、かつ、タンパク質の立体構造の観点より解明することにより、この過程を数理モデル化して理解することを目的としている。このメカニズムが解明できれば、リン酸化シグナルを抑制する革新的な制がん剤の創製につながると考えている。
    多くのがん細胞においては、遺伝子変異によるRas タンパク質の活性化を起源として、その下流にあるキナーゼを活性化し、そのキナーゼは連鎖的に別のキナーゼをリン酸化・活性化する。このようなリン酸化シグナルの連鎖と増幅が、がん細胞の増殖能や浸潤能を高める。 Ser/Thr のリン酸化によるキナーゼの活性化は、14-3-3ζ の結合により持続・亢進し、14-3-3ζ の結合阻害により抑制されることが分かってきた。したがって、がんにおけるリン酸化シグナルの数理モデルを確立するためには、14-3-3ζ と各キナーゼの結合親和性や、その基盤となる複合体の立体構造を明らかにする必要がある。そこで本研究は、14-3-3ζの結合により活性化されるキナーゼや転写因子など(14-3-3ζのclientタンパク質)の全長、あるいは、14-3-3ζとの相互作用部位全体を用いた結合親和性の定量的解析、両者の複合体のX線結晶構造解析を行うことにより、リン酸化シグナルの数理モデルを構築する上での熱力学的・構造生物学的基盤を確立することを目的とする。
    本年度は、14-3-3ζのclientタンパク質のうち、キナーゼ3種類、転写因子2種類の大量発現系を構築し、大腸菌をホストとした大量発現・精製を試みた。これまでに、キナーゼおよび転写因子の各1種類について、大量発現・精製法確立に成功した。キナーゼについてはサイズ排除クロマトグラフィーにより多量体状態の解析を行い、単量体~2量体で存在することが分かった。現在、酵素処理によるリン酸化条件を検討している。転写因子については、これを基質とする別のリン酸化酵素によるリン酸化に成功した。GST融合14-3-3ζを用いたグルタチオンセファロースによるプルダウンアッセイにより、14-3-3ζとリン酸化した転写因子の高親和性結合を確認した。
    当初の計画は、以下の通りであった。
    (1) 14-3-3ζのclient タンパク質の大量調製法の確立、性状解析・活性確認 (2) 14-3-3ζとclient タンパク質全長(相互作用部位全体)の結合親和性の定量解析 (3) 14-3-3ζとclient タンパク質全長(相互作用部位全体)の複合体の結晶化 (4) 14-3-3ζと阻害剤BA およびUTKO1 との相互作用解析、複合体の立体構造解析
    <BR>
    これまでに、(1)については、転写因子およびタンパク質キナーゼの大量調製に成功し、特に転写因子についてはリン酸化方法を確立し、プルダウンアッセイによりリン酸化の有無による14-3-3ζとの結合親和性の変化の検出に成功した。(2)、(3)への取り組みを開始したところである。(4)については、未着手である。
    当初の計画の(2)、(3)については、結晶化に成功し次第、X線結晶構造解析を行う。
    また、大量調製法が確立できていない転写因子とタンパク質リン酸化酵素については、発現条件の検討を行う。

  • B型肝炎ウイルスの肝細胞侵入および増殖機構の構造生物学的解析

    2018.04
    -
    2021.03

    Keio University, 横川 真梨子, 大澤 匡範, Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

     View Summary

    B型肝炎ウイルス(HBV)が肝細胞に特異的に侵入する分子機構、およびHBVが宿主の肝細胞内で増殖する分子機構を構造生物学的に明らかにすることにより、HBVの肝細胞への侵入や宿主細胞内での増殖の阻害という新たな作用点を持つ画期的抗HBV薬を創製することを目指している。
    本年度は、前年度に引き続きHBVの受容体であるNTCPの調製法確立を行った。無細胞タンパク質合成系にて不溶性画分として合成したNTCPを界面活性剤により可溶化し、HBVの外殻タンパク質のpreS1領域との相互作用解析を行ったが、調製したNTCPはpreS1結合活性を持たないことが分かった。そこで、無細胞タンパク質合成の反応液に脂質と界面活性剤を添加し、透析しながら合成反応を行うことで、NTCPをプロテオリポソームとして調製した。調製したNTCPリポソームがpreS1結合活性を有することを、共沈降実験により確認した。今後、preS1とNTCPリポソームの相互作用の溶液NMR解析を行い、preS1上のNTCP結合残基およびNTCP結合時のpreS1の立体構造を解明する。また、リポソーム中のNTCPのNa+・胆汁酸共輸送活性を確認する。
    HBVの増殖に重要なキャプシドとLHBsの相互作用については、キャプシドと結合するLHBsの残基をさらに絞り込むため、preS1、preS2を短くしたペプチド5種の大腸菌発現系を構築し、解析に必要な量のペプチドを調製した。今後、溶液NMR法と等温滴定型カロリメトリーを用いて、各ペプチドとキャプシドの相互作用様式を定量的に明らかにする。
    PreSとNTCPの相互作用による肝細胞侵入機構の解明について、無細胞タンパク質合成系を用いて不溶性画分として合成したNTCPを界面活性剤で可溶化した場合は、preS1結合活性がほとんどないことが分かったため、NTCPの調製方法の変更が必要になった。そこで、反応液に脂質と界面活性剤を添加して透析を行いながらNTCPを合成することで、NTCPをプロテオリポソームとして調製することに成功し、preS1結合活性を有することを確認した。
    キャプシドとLHBsの相互作用による宿主の肝細胞内におけるウイルス再構築機構の解明に向けては、キャプシドとペプチドを問題なく調製できており、両者の相互作用解析や立体構造解析を行う準備が整っている。
    無細胞タンパク質合成系を用いて調製したNTCPリポソームとpreS1の相互作用の溶液NMR解析を行い、preS1上のNTCP結合残基、およびNTCP結合時のpreS1の立体構造を明らかにする。
    キャプシドとの結合に重要なLHBs中の領域を溶液NMR法により特定し、複合体の構造をX線結晶構造解析またはクライオ電子顕微鏡法により解明する。

  • Functional regulation of voltage-gated ion channels targeting the voltage sensor

    2017.04
    -
    2020.03

    MEXT,JSPS, Grant-in-Aid for Scientific Research, Osawa Masanori, 横川 真梨子, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Principal Investigator

     View Summary

    Voltage-gated ion channels (VGICs) are membrane proteins in charge of neural transmission and heart beats, which are important targets such as arrhythmia. The VGICs sense the changes of the membrane potential by its voltage-sensing domains (VSD), whose conformational changes allosterically regulates the ion-gate opening and closing. However, its mechanism has been elusive.
    We prepared hERG K+ ion channel and its specific toxin that binds to the VSD of hERG, and identified their interacting residues that are important the functional regulation of hERG. This study provides molecular basis of the channel inhibition and allosteric regulation of the hERG activity.

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Awards 【 Display / hide

  • Best Poster Award

    Masanori Osawa, 2016.07, The organizing committee of International and Interdisciplinary Symposium 2016, Structural Basis for the Inhibition of Voltage-dependent K+ Channel by Gating Modifier Toxin

    Type of Award: Other Awards

  • 長瀬研究振興賞

    2016.04, NAGASE Science Technology Foundation, Development of novel nanodisc that enables solution NMR analyses of membrane protein interactions in the lipid bilayer

    Type of Award: Other Awards

 

Courses Taught 【 Display / hide

  • STUDY OF MAJOR FIELD:(PHYSICS FOR LIFE FUNCTIONS)

    2021

  • SEMINAR:(PHYSICS FOR LIFE FUNCTIONS)

    2021

  • RESEARCH FOR BACHELOR'S THESIS 1

    2021

  • PHYSICAL CHEMISTRY

    2021

  • PHARMACEUTICAL-ENGLISH SEMINAR

    2021

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Courses Previously Taught 【 Display / hide

  • Analytical Chemistry

    Keio University, 2018, Spring Semester, Major subject, Lecture, Within own faculty, 1h, 240people

  • 物理分析学

    Keio University, 2018, Autumn Semester, Major subject, Lecture, 220people

  • Basic pharmaceutical sciences laboratory course

    Keio University, 2018, Autumn Semester, Major subject, Laboratory work/practical work/exercise, 240people

  • Basic physics

    Keio University, 2015, Spring Semester, General education subject, Lecture, Within own faculty, 1h, 183people

  • Physical chemistry (3)B

    Keio University, 2015, Autumn Semester, Major subject, Lecture, 240people

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