土居　信英 （ドイ　ノブヒデ）

Doi, Nobuhide

写真a

所属（所属キャンパス）

理工学部 生命情報学科 （矢上）

職名

教授

HP
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総合紹介 【 表示 ／ 非表示 】

  • 専門は生物物理、分子生物学。タンパク質を軸とした新しいバイオテクノロジーを創出し、そのオリジナルな技術を利用して物理的視点から生命を理解したい。現在のテーマは、試験管内進化を利用した新しいタンパク質のデザインと生命の起源・進化の実験的証明、ポストゲノム時代のタンパク質相互作用の網羅的解析技術の開発。

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経歴 【 表示 ／ 非表示 】

  • 1997年04月
    -
    2000年03月

    三菱化学生命科学研究所

  • 2000年04月
    -
    2002年03月

    慶應義塾大学理工学部応用化学科 助手

  • 2002年04月
    -
    2003年03月

    慶應義塾大学理工学部生命情報学科 助手

  • 2003年04月
    -
    2008年03月

    慶應義塾大学理工学部生命情報学科 専任講師

  • 2005年10月
    -
    2007年09月

    兼慶應義塾大学理工学部生命情報学科 広報委員

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学歴 【 表示 ／ 非表示 】

  • 1997年03月

    北海道大学, 地球環境科学研究科, 生態環境科学専攻

    大学院, 修了, 博士

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学位 【 表示 ／ 非表示 】

  • 地球環境科学　, 北海道大学, 1997年03月

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研究分野 【 表示 ／ 非表示 】

  • ものづくり技術（機械・電気電子・化学工学） / バイオ機能応用、バイオプロセス工学 （生物機能工学）

  • ライフサイエンス / 応用分子細胞生物学 （バイオテクノロジー）

  • ライフサイエンス / 分子生物学

  • ライフサイエンス / 生物物理学

  • ライフサイエンス / システムゲノム科学 （蛋白質ネットワーク）

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研究キーワード 【 表示 ／ 非表示 】

  • ドラッグデリバリーシステム

  • プロテオミクス

  • 合成生物学

  • 抗体工学

  • 進化分子工学

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著書 【 表示 ／ 非表示 】

  • ドラッグデリバリーシステム - バイオ医薬品創成に向けた組織、細胞内、核内送達技術の開発-

    土居信英, シーエムシー出版, 2018年06月

    担当範囲: pp.131-137

  • 医療・診断をささえるペプチド科学 - 再生医療・DDS・診断への応用 -

    土居信英, シーエムシー出版, 2017年10月

    担当範囲: pp.232-238

  • ペプチド医薬品のスクリーニング・安定化・製剤化技術

    須藤慧，藤原慶，土居信英, 技術情報協会, 2017年

  • 進化分子工学　～高速分子進化によるタンパク質・核酸の開発～

    土居 信英、柳川弘志, NTS出版, 2013年10月

    担当範囲: pp.275-286

  • 次世代医薬開発に向けた抗体工学の最前線

    土居信英, シーエムシー出版, 2012年12月

    担当範囲: pp.66-73

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論文 【 表示 ／ 非表示 】

  • STALL-seq: mRNA-display selection of bacterial and eukaryotic translational arrest sequences from large random-sequence libraries

    Hamano T., Nagumo Y., Umehara T., Hirono K., Fujiwara K., Taguchi H., Chadani Y., Doi N.

    Journal of Biological Chemistry 300 （ 12 ） 107978 2024年12月

    ISSN  00219258

    　概要を見る

    The translational arrest is a phenomenon wherein a temporary pause or slowing of the translation elongation reaction occurs due to the interaction between ribosome and nascent peptide. Recent studies have revealed that translational arrest peptides are involved in intracellular protein homeostasis regulatory functions, such as gene expression regulation at the translational level and regulation of cotranslational protein folding. Herein, we established a method for the large-scale in vitro selection of translational arrest peptides from DNA libraries by combining a modified mRNA display method and deep sequencing. We performed in vitro selection of translational arrest sequences from random-sequence libraries via mRNA display based on the Escherichia coli PURE system or wheat germ extract. Following several rounds of affinity selection, we obtained various candidate sequences that were not similar to known arrest peptides and subsequently confirmed their ribosome stalling activity by peptidyl-tRNA detection and toeprinting assay. Following the site-directed mutagenesis of the selected sequences, these clones were found to contain novel arrest peptide motifs. This method, termed STALL-seq (Selection of Translational Arrest sequences from Large Library sequencing), could be useful for the large-scale investigation of translational arrest sequences acting on both bacterial and eukaryotic ribosomes and could help discover novel intracellular regulatory mechanisms.

  • Lipid nanoparticle-encapsulated DOCK11-siRNA efficiently reduces hepatitis B virus cccDNA level in infected mice

    Okada H., Sakamoto T., Nio K., Li Y., Kuroki K., Sugimoto S., Shimakami T., Doi N., Honda M., Seiki M., Kaneko S., Yamashita T.

    Molecular Therapy Methods and Clinical Development 32 （ 3 ） 101289 2024年09月

    ISSN  2329-0501

    　概要を見る

    The hepatitis B virus (HBV) infects many people worldwide. As HBV infection frequently leads to liver fibrosis and carcinogenesis, developing anti-HBV therapeutic drugs is urgent. Therapeutic drugs for preventing covalently closed circular DNA (cccDNA) production, which can eliminate HBV infection, are unavailable. The host factor dedicator of cytokinesis 11 (DOCK11) is involved in the synthesis and maintenance of HBV cccDNA in vitro. However, the effectiveness of DOCK11 as a target for the in vivo elimination of HBV cccDNA remains unclear. In this study, we assess whether DOCK11 inhibitors suppress HBV cccDNA production in mouse models of HBV infection. The tocopherol-conjugate hetero- gapmer, a DNA/RNA duplex of gapmer/complementary RNA targeting the DOCK11 sequence, partially reduces the expression of DOCK11, but not that of HBV cccDNA, in the livers of HBV-infected human hepatocyte chimeric mice, along with weight loss and decreased serum human albumin levels. Lipid nanoparticle-encapsulated chemically modified siRNAs specific for DOCK11 suppress DOCK11 expression and decrease HBV cccDNA levels without adverse effects in the mice. Therefore, nucleic acid-based drugs targeting DOCK11 in hepatocytes are potentially effective anti-HBV therapeutics that can reduce HBV cccDNA levels in vivo.

  • Cell-Free Protein Expression by a Reconstituted Transcription–Translation System Energized by Sugar Catabolism

    Sato G., Miyazawa S., Doi N., Fujiwara K.

    Molecules 29 （ 13 ）  2024年07月

    　概要を見る

    Cooperation between catabolism and anabolism is crucial for maintaining homeostasis in living cells. The most fundamental systems for catabolism and anabolism are the glycolysis of sugars and the transcription–translation (TX-TL) of DNA, respectively. Despite their importance in living cells, the in vitro reconstitution of their cooperation through purified factors has not been achieved, which hinders the elucidation of the design principle in living cells. Here, we reconstituted glycolysis using sugars and integrated it with the PURE system, a commercial in vitro TX-TL kit composed of purified factors. By optimizing key parameters, such as glucokinase and initial phosphate concentrations, we determined suitable conditions for their cooperation. The optimized system showed protein synthesis at up to 33% of that of the original PURE system. We observed that ATP consumption in upstream glycolysis inhibits TX-TL and that this inhibition can be alleviated by the co-addition of glycolytic intermediates, such as glyceraldehyde 3-phosphate, with glucose. Moreover, the system developed here simultaneously synthesizes a subset of its own enzymes, that is, glycolytic enzymes, in a single test tube, which is a necessary step toward self-replication. As glycolysis and TX-TL provide building blocks for constructing cells, the integrated system can be a fundamental material for reconstituting living cells from purified factors.

  • Metabolic Tug-of-War between Glycolysis and Translation Revealed by Biochemical Reconstitution

    Sato G., Kinoshita S., Yamada T.G., Arai S., Kitaguchi T., Funahashi A., Doi N., Fujiwara K.

    ACS Synthetic Biology 13 （ 5 ） 1572 - 1581 2024年05月

    　概要を見る

    Inside cells, various biological systems work cooperatively for homeostasis and self-replication. These systems do not work independently as they compete for shared elements like ATP and NADH. However, it has been believed that such competition is not a problem in codependent biological systems such as the energy-supplying glycolysis and the energy-consuming translation system. In this study, we biochemically reconstituted the coupling system of glycolysis and translation using purified elements and found that the competition for ATP between glycolysis and protein synthesis interferes with their coupling. Both experiments and simulations revealed that this interference is derived from a metabolic tug-of-war between glycolysis and translation based on their reaction rates, which changes the threshold of the initial substrate concentration for the success coupling. By the metabolic tug-of-war, translation energized by strong glycolysis is facilitated by an exogenous ATPase, which normally inhibits translation. These findings provide chemical insights into the mechanism of competition among biological systems in living cells and provide a framework for the construction of synthetic metabolism in vitro.

  • Multimolecular Competition Effect as a Modulator of Protein Localization and Biochemical Networks in Cell-Size Space

    Nishikawa S., Sato G., Takada S., Kohyama S., Honda G., Yanagisawa M., Hori Y., Doi N., Yoshinaga N., Fujiwara K.

    Advanced Science 11 （ 6 ） e2308030 2024年02月

    　概要を見る

    Cells are small, closed spaces filled with various types of macromolecules. Although it is shown that the characteristics of biochemical reactions in vitro are quite different from those in living cells, the role of the co-existence of various macromolecules in cell-size space remains still elusive. Here, using a constructive approach, it is demonstrated that the co-existence of various macromolecules themselves has the ability to tune protein localization for spatiotemporal regulation and a biochemical reaction system in a cell-size space. Both experimental and theoretical analyses reveal that enhancement of interfacial effects by a large surface-area-to-volume ratio facilitates membrane localization of molecules in the cell-size space, and the interfacial effects are alleviated by competitive binding to lipid membranes among multiple proteins even if their membrane affinities are weak. These results indicate that competition for membrane binding among various macromolecules in the cell-size space plays a role in regulating the spatiotemporal molecular organization and biochemical reaction networks. These findings shed light on the importance of surrounding molecules for biochemical reactions using purified elements in small spaces.

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KOARA（リポジトリ）収録論文等 【 表示 ／ 非表示 】

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総説・解説等 【 表示 ／ 非表示 】

  • mRNAディスプレイによる翻訳アレスト配列の大規模探索

    濱野理，土居信英

    生物工学 （日本生物工学会）  97 （ 8 ） 10 - 12 2019年08月

    記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）, 共著

  • ヒト由来膜融合ペプチドによるバイオ医薬のDDS

    土居 信英

    細胞 49 （ 12 ） 602 - 605 2017年10月

    記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）, 単著

  • マイクロカプセルを利用した制限酵素および受容体リガンドの試験管内選択法

    土居 信英, 柳川 弘志

    バイオテクノロジージャーナル 1 （ 1-2 ） 84 - 86 2005年01月

    記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）, 共著

  • 生命の理解と制御に向けた遺伝子ネットワーク解析

    土居 信英, 柳川 弘志

    Bioベンチャー 4 （ 4 ） 54 - 56 2004年07月

    記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）, 共著

  • タンパク質相互作用のハイスループット解析に向けて―新しい蛍光標識法とマイクロアレイ技術の融合

    土居 信英, 柳川 弘志

    Bioベンチャー 2   102 - 105 2002年06月

    記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）, 共著

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研究発表 【 表示 ／ 非表示 】

  • Second extracellular loop of human CD9 is a cell-penetrating peptide

    Kumeno, Y., Sudo, K., Fujiwara, K., Doi, N.

    The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies （Honolulu, Hawaii, online） , 

    2021年12月
    , 

    ポスター発表

  • Application of human syncytin1-derived fusogenic peptide to direct intracellular delivery of Cas9 protein-gRNA complex

    Furuya, T., Fujiwara, K., Doi, N.

    The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies （Honolulu, Hawaii, online） , 

    2021年12月
    , 

    ポスター発表

  • がん細胞選択的DDSに向けたEGFRに対する環境応答性単一ドメイン抗体の創出

    明石尚之，清野真梨子，藤原慶，土居信英

    第44回日本分子生物学会年会 （横浜） , 

    2021年12月
    , 

    ポスター発表

  • 膜透過性ペプチドを用いたCas9タンパク質-gRNA複合体の直接的な細胞内送達

    古屋智規，藤原慶，土居信英

    第43回日本分子生物学会年会 （オンライン） , 

    2020年12月
    , 

    ポスター発表

  • 細胞選択的なタンパク質デリバリーのためのヒト・シンシチン1由来膜透過促進ペプチドの最適化

    前村帆南，藤原慶，土居信英

    第43回日本分子生物学会年会 （オンライン） , 

    2020年12月
    , 

    ポスター発表

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競争的研究費の研究課題 【 表示 ／ 非表示 】

  • 感染症の標的となる細胞内因子に対するバイオ医薬の創出・送達技術の開発

    2023年04月
    -
    2027年03月

    科学研究費助成事業, 土居 信英, 基盤研究(A), 補助金,  研究代表者

    　研究概要を見る

    本研究では、申請者らが発見したヒト由来の膜透過促進ペプチドを利用したタンパク質・核酸の細胞質送達技術と、独自のmRNAディスプレイ法による小型抗体の試験管内選択技術を利用して、感染症の標的となる細胞内の因子に対するバイオ医薬の創出・送達手法を確立することを目的とする。これまで感染症に対するバイオ医薬の標的はウイルス・細菌の表面タンパク質や受容体など細胞外の分子に限られていたが、本研究を契機として、病原体の耐性獲得に左右されにくい細胞内の分子を標的とすることが可能になれば、我が国の感染症に対するバイオ創薬技術の基盤強化、ひいては国民の医療・福祉の向上に大いに貢献することが期待できる。
    （1）HBV感染細胞のcccDNAを完全駆除する核酸医薬の開発（土居・岡田）
    肝細胞特異的に発現しているアシアロ糖タンパク質受容体(ASGR)に結合する小型抗体やASGRのリガンドであるtri-GalNAcと、ヒトSyncytin1やIZUMO1由来の様々な膜透過促進ペプチドを組み合わせて融合したAgo2タンパク質をキャリアとして、siRNA医薬を肝細胞選択的に効率よく細胞質送達できる全く新しいDDSを開発するために、蛍光タンパク質をモデルとして共焦点顕微鏡観察することで、コンストラクトの最適化を進めた。また、DOCK11以外の新たな標的を見い出すために、野生型とAAV8-HBV1.3mer慢性感染モデルマウスの肝組織を用いたシングルセルトランスクリプトーム解析を行い、HBV関連遺伝子と宿主側の遺伝子を区別して空間的な情報を得ることができた。
    （2）クレブシエラ菌感染を阻害する小型抗体医薬の開発（土居・津川）
    Axlの細胞内ドメイン(ICD)の様々な部位に結合する多様な小型抗体を１次セレクションし、その中から、所望の経路のみを活性化する小型抗体の２次スクリーニングを行うために、１年目は、Axl(ICD)の部分断片にビーズ固定用のタグを融合した遺伝子の発現用プラスミドを構築し、大量発現・精製した。Axl(ICD)断片が非天然変性領域を含むため苦労したが、ビーズへの固定を確認することができた。また、クレブシエラ菌感染下におけるAxl/Gas6シグナルの亢進がTight-junctionの増強と同時に腸管上皮細胞における細胞増殖も増強することをin vitro感染モデル試験にてki67染色を指標に明らかにした。このin vitroモデルを小型抗体の2次スクリーニングに利用することで、細胞増殖の誘導を引き起こさない医薬品の開発が可能になると考えられる。
    ASGRに結合する小型抗体やASGRのリガンドである tri-GalNAc と、ヒト Syncytin1 や IZUMO1 由来の様々な膜透過促進ペプチドを組み合わせて融合したタンパク質の肝細胞選択的な取り込みを確認できたこと、また、Axl(ICD) の各部位に結合する多様な小型抗体のセレクションに必要となるAxl(ICD) の部分断片を調製できたことから、おおむね順調に進展していると判断した。
    (1) HBV感染細胞のcccDNAを完全駆除する核酸医薬の開発（土居・岡田）
    前年度に引き続き、Ago2融合タンパク質とsiRNAの複合体をヒト培養細胞に添加し、肝細胞選択的に細胞内に送達されることを共焦点顕微鏡観察により確認することで、コンストラクトの最適化を進める。また、複合体が細胞質で標的mRNAを分解していることを確認するために、ヒト培養細胞の内在遺伝子やDOCK11に対するsiRNAとの複合体を肝細胞由来の培養細胞に送達し、培養細胞から抽出した標的遺伝子に対するmRNA量をRT-qPCRで定量する。さらに、前年度のHBV複製に関わる遺伝子情報の包括的解析から、核酸創薬に適した標的細胞から数種類の標的遺伝子まで絞り込み、先行したDOCK11の研究基盤データと比較して、新たな核酸創薬に最適な標的遺伝子を同定する。
    (2) クレブシエラ菌感染を阻害する小型抗体医薬の開発（土居・津川）
    mRNAディスプレイ法により、すでに構築済みのヒト単一ドメイン抗体ライブラリーから、前年度に調製したAxl(ICD)に結合する小型抗体を試験管内選択する。その後、１次セレクションで得られた小型抗体を腸管上皮細胞由来 Caco-2細胞で発現させることでTight-junctionタンパク質の発現が変化するクローンを２次スクリーニングする。このときTight-junctionタンパク質のプロモーター細胞の構築と合わせて、クレブシエラ菌感染下におけるAxl/Gas6シグナルを確認し、クレブシエラ感染症予防に最適な２次スクリーニング技術を確立し利用する。

  • 肝微小環境の構造理解に基づく新たな代謝性肝疾患治療の確立

    2021年04月
    -
    2025年03月

    科学研究費助成事業, 本多 政夫, 堀本 勝久, 土居 信英, 岡田 光, 基盤研究(A), 補助金,  研究分担者

    　研究概要を見る

    NASHは脂肪化・炎症・線維化を伴って進行し、肝不全や肝発癌発生の要因となる。本研究では肝微小環境の構造理解に基づく新たな代謝性肝疾患治療の確立を行う。肝類洞内皮で高発現するSema6AはSema6A-PlxnA2シグナルを介して肝星細胞の活性化を抑制し抗線維化治療分子として有用な可能性が示唆される。Sema6Aの肝類洞内皮における本来の生理機能を解き明かすことにより、肝再生機構、肝類洞の細動脈化機構、線維化、炎症の機転を解明する。類洞という肝微小構造の解剖学的特徴を利用し、効果的なSema6Aの投与方法を確立する。さらには、PlxnA2をターゲットとした新たな代謝性肝疾患治療を確立する。

  • 独自の膜透過促進ペプチドを利用した簡便かつ汎用的なゲノム編集技術の開発

    2020年10月
    -
    2022年03月

    科学技術振興機構　A-STEPトライアウト, 補助金,  研究代表者

  • 細胞内の創薬ターゲットに対するがん細胞選択的な膜透過抗体医薬の開発

    2020年04月
    -
    2024年03月

    文部科学省・日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 土居 信英, 基盤研究(B), 補助金,  研究代表者

    　研究概要を見る

    本研究では、申請者らが最近発見したヒトSyncytin1由来の膜透過促進ペプチドと、独自のmRNAディスプレイ法による小型ドメイン抗体や人工ペプチドリガンドの試験管内選択技術を利用して、これまでバイオ医薬の創薬ターゲットにできなかった細胞内の疾患標的を対象とする画期的な抗がん剤の開発のための要素技術を確立することを目的とする。従来の抗体医薬による細胞外のターゲットだけではなく、「細胞内に広がっている未開の領域」を新たに創薬ターゲットとすることが可能になれば、我が国のバイオ創薬技術の基盤強化、ひいては国民の医療・福祉の向上に多いに貢献することが期待できる。
    本研究計画では、これまで創薬ターゲットとすることが困難であったがん細胞内の疾患標的に結合するバイオ医薬を、がん細胞選択的に細胞内に送達させることで、２重の鍵をもつきわめて副作用の少ないがん細胞選択的膜透過バイオ医薬を開発することを目的としている。細胞内の疾患標的に対するバイオ医薬として、mRNAディスプレイ法により当研究室で作製済みのアンドロゲン受容体（AR）スプライスバリアント7 (AR-V7) に対する小型ドメイン抗体を用いるが、抗体医薬だけではなくペプチド医薬や核酸医薬についても並行して検討することでリスクヘッジすることを計画している。
    まず、核酸医薬として、AR-V7に対するsiRNAとAgo2タンパク質とのRNA-タンパク質複合体を細胞質に効率よく送達させるために、独自のヒトSyncytin1由来膜透過促進ペプチドを融合したAgo2タンパク質を昆虫細胞で大量発現・精製し、ヒト培養細胞に添加した結果、ARおよびAR-V7遺伝子の共通部分配列に対するsiRNAを用いた場合に、標的遺伝子が従来法よりも効率よくノックダウンされることをRT-qPCRにより確認できた（論文投稿中）。
    また、ペプチド医薬のモデルとして、アポトーシス誘導ペプチドを細胞選択的に細胞質に送達させるために、膜透過促進ペプチドをLDL受容体結合ペプチドとともにアポトーシス誘導ペプチドに融合したタンパク質を大腸菌で大量発現・精製し、ヒト培養細胞に添加したところ、LDL受容体発現細胞選択的な細胞生存率の減少とアポトーシス誘導によるカスパーゼの切断を確認できた（学会発表済み、論文投稿中）。
    さらに、AR-V7に対する抗体医薬をがん細胞選択的に細胞内デリバリーするために、初年度は、様々ながん細胞で高発現しているEGFRを認識する人工ペプチドリガンドおよび小型抗体をmRNAディスプレイ法により試験管内選択した。
    コロナ禍で前半は実験ができない期間があったこともあり、今年度から新たに始めたEGFRを認識する人工ペプチドリガンドおよび小型抗体のmRNAディスプレイ法による試験管内選択については年度内に終えることができなかったが、これまでに利用していたLDL受容体結合ペプチドを利用した細胞選択的DDSについては論文投稿に必要なデータを揃えることができた。また、抗体医薬の細胞質送達については次年度に継続して検討を進めるが、核酸医薬とペプチド医薬についてはモデル系で細胞質送達を確認することができたことから、全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。
    前年度に引き続き、がん細胞表面マーカーとして、様々ながん細胞で高発現しているEGFRやHER2を認識するpH応答性の人工ペプチドリガンドまたは小型ドメイン抗体をmRNAディスプレイ法により試験管内選択する。創出したEGFR／HER2結合ペプチドリガンド／抗体、および、ヒトSyncytin1由来膜透過促進ペプチドを核移行配列とともにAR-V7に対する小型ドメイン抗体に融合したタンパク質を大腸菌で大量発現・精製する。これを前立腺がん由来LNCaP細胞または22Rv1細胞の培地に添加したとき、細胞質および核内に取り込まれ、ARおよびAR-V7の転写活性を阻害することを、AR転写調節領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したレポータージーンアッセイにより確認する。さらに、制がん活性評価のために、22Rv1細胞またはLNCaP細胞にジヒドロテストステロンを添加したときに誘導されるPSAの発現をRT-qPCRで評価する。
    また、独自のヒトSyncytin1由来ペプチドの膜透過促進活性の向上に資するために変異解析を行い、機能に重要なアミノ酸を特定する。具体的には、部位特異的変異を導入した膜透過促進ペプチドを、上記受容体結合ペプチドリガンド／抗体とともに蛍光タンパク質に融合したタンパク質を大腸菌で大量発現・精製し、受容体発現ヒト培養細胞に添加したときの細胞内取り込みの変化を共焦点蛍光顕微鏡で観察する。

  • 胃癌幹細胞及び同前駆細胞を駆逐する二段階分子標的療法の開発

    2020年04月
    -
    2023年03月

    科学研究費助成事業, 鈴木 秀和, 佐藤 智典, 津川 仁, 土居 信英, 基盤研究(B), 補助金,  研究分担者

    　研究概要を見る

    研究代表者らは、ヒト胃癌組織 で、アクチン重合制御蛋白質CAPZA1の過剰発現細胞が、CD44v9陽性癌幹細胞の前駆細胞となることを報告し、CAPZA1の機能制御がCD44v9陽性胃癌幹細胞の発生阻害に繋がることを示した。本研究は、CD44v9陽性癌幹細胞の発生を阻害する分子標的型CAPZA1高親和性ハイブリッドペプチド／抗体と、癌部で既に発生しているCD44v9 陽性癌幹細胞の選択的排除能を有する分子標的型複合ナノ微粒子を創出する。設計・開発された分子標的バイオ医薬は、ヒト胃癌オルガノイド由来mucosoidを用いて機能評価し、癌幹細胞標的療法として創薬応用する。
    胃オルガノイド由来幹細胞駆動型上皮細胞モデルMucosoidを用いた解析では、酪酸刺激にて、胃上皮細胞のCAPZA1発現は顕著に亢進し、H. pylori感染により、CAPZA1過剰発現細胞依存的にCagAが蓄積していくことが、Westernblotting並びに共焦点レーザー顕微鏡解析による免疫染色法により明らかになった。また、mRNAディスプレイ技術を用いて、CAPZA1を分子標的した蛋白質相互作用阻害ペプチドの開発とスクリーニングを行い、CD44v9陽性細胞の発生制御技術の開発を行っている。CAPZA1にビーズ固定用のSBPタグを融合したCAPZA1-SBP蛋白質を大腸菌で大量発現・精製し、AGS細胞抽出液に含まれるLRP1-ICDとの結合を確認することができた。mRNAディスプレイ技術によるCAPZA1結合ペプチドのセレクション探索と並行して、まず野生型LRP1-ICDに膜透過促進ペプチドS19-TATとeGFPを融合したタンパク質を大腸菌で調製した。調製されたeGFP-LRP1(ICD)-S19-TAT融合蛋白質をAGS細胞に添加すると、膜透過促進ペプチドS19の機能によりLRP1-ICDの細胞内移行が促進した。また、CD44v9を特異的に標的するために、CD44v9陽性細胞に特異的な多糖ナノ粒子による遺伝子のデリバリーシステムの開発を行った。異なる組成の多糖ナノ粒子での検討を行うことで、ルシフェラーゼ遺伝子(pLuc)／キトサン／ヒアルロン酸の三元複合体では、CD44v9陽性細胞に特異的な遺伝子の細胞内導入、微小管依存的な核への輸送、および顕著な遺伝子発現活性が得られた。この成果を基盤に、自殺遺伝子(pTK)含有多糖ナノ粒子を用いてCD44v9陽性細胞に対する抗腫瘍効果を検討している。
    本研究では、CAPZA1過剰発現細胞、およびCD44v9陽性癌幹細胞を標的とした次世代分子標的バイオ医薬を開発し、「癌幹細胞/前駆細胞選択的二段階駆逐型新規癌治療戦略」の確立を目的としている。令和2年度の研究成果により、胃内共生細菌由来代謝物依存的なCAPZA1過剰発現を介したCD44v9陽性細胞の発生機構が胃オルガノイドを用いたモデルで明確化され、その細胞の標的技術として、mRNAディスプレイ法とキトサン/ヒアルロン酸(HA)で構成したナノ粒子への自殺遺伝子のパッケージング法の開発が順調に進んでいる。今後、これらの標的技術の精度の向上と、標的化の実践の確認のために、胃オルガノイドモデルを用いた機能評価が必要となるが、ここまでの研究開発により標的技術の開発はおおむね順調に進んでいる。
    令和2年度の成果により、mRNAディスプレイ法を用いたCAPZA1過剰発現細胞の標的技術開発では、CAPZA1にビーズ固定用のSBPタグを融合したCAPZA1-SBP蛋白質を大腸菌で大量発現・精製し、AGS細胞抽出液に含まれるLRP1-ICDとの結合を確認することができたので、今後、CAPZA1-SBPをベイトとしたmRNAディスプレイ法を用いて、CAPZA1に結合するペプチドまたは小型抗体のセレクションを行う。また、調製されたeGFP-LRP1(ICD)-S19-TAT融合蛋白質をAGS細胞に添加すると、膜透過促進ペプチドS19の機能によりLRP1-ICDの細胞内移行が促進したが、過剰なLRP1-ICDの細胞内移行により細胞死が誘導され、LRP1-ICDの細胞内移行量の調節技術が必要になることが示唆されたため、CAPZA1過剰発現細胞特異的にLRP1-ICDを送達させることを目的に、CAPZA1過剰発現特異的な細胞表層受容体の探索・同定をAGS培養細胞とMucosoidモデルを用いて実施する予定である。さらに、ルシフェラーゼ遺伝子(pLuc)／キトサン／ヒアルロン酸の三元複合体糖ナノ粒子では、CD44v9陽性細胞に特異的な遺伝子の細胞内導入、微小管依存的な核への輸送、および顕著な遺伝子発現活性が得られたため、今後、この糖ナノ粒子内へ自殺遺伝子(pTK)をパッケージングし、CD44v9陽性細胞特異的な抗腫瘍効果をMucosoidモデルにて検討する。

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知的財産権等 【 表示 ／ 非表示 】

  • 融合タンパク質又は複合タンパク質，細胞内送達用担体，部分ペプチド，細胞膜透過促進剤，DNA，及びベクター

    出願日： PCT/JP2016/066455  2015年06月 

    発行日： 6864364 

    登録日： 2021年04月

    特許権, 共同

  • 物質と蛋白質との間の相互作用の検出方法

    出願日： 2001-239175  2001年08月 

    発行日： 3706942  2004年11月

    特許権, 共同

  • C末端修飾タンパク質の製造とその利用方法

    出願日： 2000-373105  2000年11月 

    発行日： 3750020  2005年12月

    特許権, 共同

  • タンパク質-ＤＮＡ連結分子及びその利用

    出願日： 2000-244061  2000年08月 

    公開日： 2001-128690  2001年05月 

    発行日： 04122694 

    登録日： 2008年05月

    特許権, 共同

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担当授業科目 【 表示 ／ 非表示 】

  • 生命システム情報特別講義Ａ

    2025年度

  • 生命情報特別講義第１

    2025年度

  • 生命情報輪講

    2025年度

  • 分子生物学第２

    2025年度

  • 分子生物学第１

    2025年度

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担当経験のある授業科目 【 表示 ／ 非表示 】

  • 微生物学

    慶應義塾

    2015年04月
    -
    2016年03月
    , 

    春学期, 講義

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所属学協会 【 表示 ／ 非表示 】

  • 日本生物工学会, 

    2014年
    -
    継続中

  • 日本DDS学会, 

    2014年
    -
    継続中

  • 細胞を創る研究会, 

    2013年
    -
    継続中

  • 日本癌学会, 

    2010年
    -
    継続中

  • 日本分子生物学会, 

    1994年
    -
    継続中

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委員歴 【 表示 ／ 非表示 】

  • 2018年01月
    -
    2021年12月

    JB編集委員会 編集委員 (Associate Editor), 日本生化学会

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