Doi, Nobuhide

写真a

Affiliation

Faculty of Science and Technology, Department of Biosciences and Informatics （Yagami）

Position

Professor

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Profile Summary 【 Display / hide 】

  • '''''''This laboratory focuses on the biophysics/biotechnology of macromolecules, especially proteins, used to develop new methodologies for solving various biological problems that are resistant to conventional analytical approaches. Also studied is the development of new methods for in vitro selection and directed evolution of proteins, protein folding and design, origin and evolution of life, and high-throughput screening of protein interactions.'''''''

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Career 【 Display / hide 】

  • 1997.04
    -
    2000.03

    三菱化学生命科学研究所

  • 2000.04
    -
    2002.03

    慶應義塾大学理工学部応用化学科 助手

  • 2002.04
    -
    2003.03

    慶應義塾大学理工学部生命情報学科 助手

  • 2003.04
    -
    2008.03

    慶應義塾大学理工学部生命情報学科 専任講師

  • 2005.10
    -
    2007.09

    兼慶應義塾大学理工学部生命情報学科 広報委員

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Academic Background 【 Display / hide 】

  • 1997.03

    Hokkaido University, Graduate School of Environmental Earth Sciences, 生態環境科学専攻

    Graduate School, Completed, Doctoral course

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Academic Degrees 【 Display / hide 】

  • Environmental Science, Hokkaido University, 1997.03

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Research Areas 【 Display / hide 】

  • Manufacturing Technology (Mechanical Engineering, Electrical and Electronic Engineering, Chemical Engineering) / Biofunction and bioprocess engineering (生物機能工学)

  • Life Science / Applied molecular and cellular biology (バイオテクノロジー)

  • Life Science / Molecular biology

  • Life Science / Biophysics

  • Life Science / System genome science (蛋白質ネットワーク)

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Research Keywords 【 Display / hide 】

  • Drug delivery system

  • Proteomics

  • Synthetic Biology

  • Antibody Engineering

  • Evolutionary Molecular Engineering

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Books 【 Display / hide 】

  • ドラッグデリバリーシステム - バイオ医薬品創成に向けた組織、細胞内、核内送達技術の開発-

    土居信英, シーエムシー出版, 2018.06

    Scope: pp.131-137

  • 医療・診断をささえるペプチド科学 - 再生医療・DDS・診断への応用 -

    土居信英, シーエムシー出版, 2017.10

    Scope: pp.232-238

  • ペプチド医薬品のスクリーニング・安定化・製剤化技術

    須藤慧，藤原慶，土居信英, 技術情報協会, 2017

  • 進化分子工学　～高速分子進化によるタンパク質・核酸の開発～

    土居 信英、柳川弘志, NTS出版, 2013.10

    Scope: pp.275-286

  • 次世代医薬開発に向けた抗体工学の最前線

    土居信英, シーエムシー出版, 2012.12

    Scope: pp.66-73

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Papers 【 Display / hide 】

  • Mode selection mechanism in traveling and standing waves revealed by Min wave reconstituted in artificial cells

    Takada S., Yoshinaga N., Doi N., Fujiwara K.

    Science advances （Science advances)  8 （ 23 ） eabm8460 2022.06

    　View Summary

    Reaction-diffusion coupling (RDc) generates spatiotemporal patterns, including two dynamic wave modes: traveling and standing waves. Although mode selection plays a substantial role in the spatiotemporal organization of living cell molecules, the mechanism for selecting each wave mode remains elusive. Here, we investigated a wave mode selection mechanism using Min waves reconstituted in artificial cells, emerged by the RDc of MinD and MinE. Our experiments and theoretical analysis revealed that the balance of membrane binding and dissociation from the membrane of MinD determines the mode selection of the Min wave. We successfully demonstrated that the transition of the wave modes can be regulated by controlling this balance and found hysteresis characteristics in the wave mode transition. These findings highlight a previously unidentified role of the balance between activators and inhibitors as a determinant of the mode selection of waves by RDc and depict an unexplored mechanism in intracellular spatiotemporal pattern formations.

  • Guanine nucleotide exchange factor DOCK11-binding peptide fused with a single chain antibody inhibits Hepatitis B Virus infection and replication.

    Ide M, Tabata N, Yonemura Y, Shirasaki T, Murai K, Wang Y, Ishida A, Okada H, Honda M, Kaneko S, Doi N, Ito S, Yanagawa H

    The Journal of biological chemistry    102097 2022.06

    ISSN  0021-9258

  • Characterization of the membrane penetration-enhancing peptide S19 derived from human syncytin-1 for the intracellular delivery of TAT-fused proteins

    Suzuki M., Iwaki K., Kikuchi M., Fujiwara K., Doi N.

    Biochemical and Biophysical Research Communications （Biochemical and Biophysical Research Communications)  586   63 - 67 2022.01

    ISSN  0006291X

    　View Summary

    Although cell-penetrating peptides such as the HIV-derived TAT peptide have been used as tools for the intracellular delivery of therapeutic peptides and proteins, a problem persists: the endosomal escape efficiency is low. Previously, we found that the fusogenic peptide S19, derived from the human protein syncytin-1, enhance the endosomal escape efficiency of proteins that incorporated by endocytosis via TAT. In this study, we first performed Ala-scanning mutagenesis of S19, and found that all Ile, Val, Leu and Phe with high β-sheet forming propensities in S19 are important for the intracellular uptake of S19-TAT-fused proteins. In a secondary structure analysis of the mutated S19-TAT peptides in the presence of liposomes mimicking late endosomes (LEs), the CD spectra of V3A and I4A mutants with low uptake activity showed the appearance of an α-helix structure, whereas the mutant G5A retained both the uptake activity and the β-structure. In addition, we investigated the appropriate linking position and order of the S19 and TAT peptides to a cargo protein including an apoptosis-induced peptide and found that both the previous C-terminal S19-TAT tag and the N-terminal TAT-S19 tag promote the cytoplasmic delivery of the fusion protein. These results and previous results suggest that the interaction of TAT with the LE membrane causes a structural change in S19 from a random coil to a β-strand and that the subsequent parallel β-sheet formation between two S19 peptides may promote adjacent TAT dimerization, resulting in endosomal escape from the LE membrane.

  • Activation of a diluted E. coli cell-free transcription-translation system within liposomes by hypertonic concentration

    Matsui Y., Akui T., Doi N., Fujiwara K.

    STAR Protocols （STAR Protocols)  2 （ 4 ） 101003 2021.12

    　View Summary

    We present a protocol for activating protein synthesis in liposomes encapsulating a diluted E. coli cell extract-based TX-TL (transcription-translation) system by hypertonic concentration. Protein expression is turned on in the liposome-encapsulated TX-TL system by simple treatment with a concentrated external solution. The expression of sfGFP is demonstrated here, but it can be applied to other proteins. This protocol can be applied to the development of artificial cells utilizing the switch-on mechanism to activate protein expression, responding to the outer environment. For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Akui et al. (2021).

  • Transcription-translation of theEscherichia coligenome within artificial cells

    Deyama T., Matsui Y., Chadani Y., Sekine Y., Doi N., Fujiwara K.

    Chemical Communications （Chemical Communications)  57 （ 80 ） 10367 - 10370 2021.10

    ISSN  13597345

    　View Summary

    Here we created artificial cells in which information of the genome of living cells is expressed by the elements encoded in the genome. We confirmed that the system works normally within artificial cells, which paves the way for reconstructing living cells from biomolecules.

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Reviews, Commentaries, etc. 【 Display / hide 】

  • mRNAディスプレイによる翻訳アレスト配列の大規模探索

    濱野理，土居信英

    生物工学 (日本生物工学会)  97 ( 8 ) 10 - 12 2019.08

    Article, review, commentary, editorial, etc. (scientific journal), Joint Work

  • ヒト由来膜融合ペプチドによるバイオ医薬のDDS

    土居 信英

    細胞 49 ( 12 ) 602 - 605 2017.10

    Article, review, commentary, editorial, etc. (scientific journal), Single Work

  • マイクロカプセルを利用した制限酵素および受容体リガンドの試験管内選択法

    土居 信英, 柳川 弘志

    バイオテクノロジージャーナル 1 ( 1-2 ) 84 - 86 2005.01

    Article, review, commentary, editorial, etc. (scientific journal), Joint Work

  • 生命の理解と制御に向けた遺伝子ネットワーク解析

    土居 信英, 柳川 弘志

    Bioベンチャー 4 ( 4 ) 54 - 56 2004.07

    Article, review, commentary, editorial, etc. (scientific journal), Joint Work

  • タンパク質相互作用のハイスループット解析に向けて―新しい蛍光標識法とマイクロアレイ技術の融合

    土居 信英, 柳川 弘志

    Bioベンチャー 2   102 - 105 2002.06

    Article, review, commentary, editorial, etc. (scientific journal), Joint Work

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Presentations 【 Display / hide 】

  • Second extracellular loop of human CD9 is a cell-penetrating peptide

    Kumeno, Y., Sudo, K., Fujiwara, K., Doi, N.

    The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (Honolulu, Hawaii, online) , 

    2021.12
    , 

    Poster presentation

  • Application of human syncytin1-derived fusogenic peptide to direct intracellular delivery of Cas9 protein-gRNA complex

    Furuya, T., Fujiwara, K., Doi, N.

    The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (Honolulu, Hawaii, online) , 

    2021.12
    , 

    Poster presentation

  • がん細胞選択的DDSに向けたEGFRに対する環境応答性単一ドメイン抗体の創出

    明石尚之，清野真梨子，藤原慶，土居信英

    第44回日本分子生物学会年会 (横浜) , 

    2021.12
    , 

    Poster presentation

  • 膜透過性ペプチドを用いたCas9タンパク質-gRNA複合体の直接的な細胞内送達

    古屋智規，藤原慶，土居信英

    第43回日本分子生物学会年会 (オンライン) , 

    2020.12
    , 

    Poster presentation

  • 細胞選択的なタンパク質デリバリーのためのヒト・シンシチン1由来膜透過促進ペプチドの最適化

    前村帆南，藤原慶，土居信英

    第43回日本分子生物学会年会 (オンライン) , 

    2020.12
    , 

    Poster presentation

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Research Projects of Competitive Funds, etc. 【 Display / hide 】

  • 肝微小環境の構造理解に基づく新たな代謝性肝疾患治療の確立

    2021.04
    -
    2025.03

    Grants-in-Aid for Scientific Research, Grant-in-Aid for Scientific Research (A), Research grant, Coinvestigator(s)

    　View Summary

    NASHは脂肪化・炎症・線維化を伴って進行し、肝不全や肝発癌発生の要因となる。本研究では肝微小環境の構造理解に基づく新たな代謝性肝疾患治療の確立を行う。肝類洞内皮で高発現するSema6AはSema6A-PlxnA2シグナルを介して肝星細胞の活性化を抑制し抗線維化治療分子として有用な可能性が示唆される。Sema6Aの肝類洞内皮における本来の生理機能を解き明かすことにより、肝再生機構、肝類洞の細動脈化機構、線維化、炎症の機転を解明する。類洞という肝微小構造の解剖学的特徴を利用し、効果的なSema6Aの投与方法を確立する。さらには、PlxnA2をターゲットとした新たな代謝性肝疾患治療を確立する。

  • 独自の膜透過促進ペプチドを利用した簡便かつ汎用的なゲノム編集技術の開発

    2020.10
    -
    2022.03

    科学技術振興機構　A-STEPトライアウト, Research grant, Principal investigator

  • 細胞内の創薬ターゲットに対するがん細胞選択的な膜透過抗体医薬の開発

    2020.04
    -
    2024.03

    MEXT,JSPS, Grant-in-Aid for Scientific Research, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Research grant, Principal investigator

    　View Summary

    本研究では、申請者らが最近発見したヒトSyncytin1由来の膜透過促進ペプチドと、独自のmRNAディスプレイ法による小型ドメイン抗体や人工ペプチドリガンドの試験管内選択技術を利用して、これまでバイオ医薬の創薬ターゲットにできなかった細胞内の疾患標的を対象とする画期的な抗がん剤の開発のための要素技術を確立することを目的とする。従来の抗体医薬による細胞外のターゲットだけではなく、「細胞内に広がっている未開の領域」を新たに創薬ターゲットとすることが可能になれば、我が国のバイオ創薬技術の基盤強化、ひいては国民の医療・福祉の向上に多いに貢献することが期待できる。
    本研究計画では、これまで創薬ターゲットとすることが困難であったがん細胞内の疾患標的に結合するバイオ医薬を、がん細胞選択的に細胞内に送達させることで、２重の鍵をもつきわめて副作用の少ないがん細胞選択的膜透過バイオ医薬を開発することを目的としている。細胞内の疾患標的に対するバイオ医薬として、mRNAディスプレイ法により当研究室で作製済みのアンドロゲン受容体（AR）スプライスバリアント7 (AR-V7) に対する小型ドメイン抗体を用いるが、抗体医薬だけではなくペプチド医薬や核酸医薬についても並行して検討することでリスクヘッジすることを計画している。
    まず、核酸医薬として、AR-V7に対するsiRNAとAgo2タンパク質とのRNA-タンパク質複合体を細胞質に効率よく送達させるために、独自のヒトSyncytin1由来膜透過促進ペプチドを融合したAgo2タンパク質を昆虫細胞で大量発現・精製し、ヒト培養細胞に添加した結果、ARおよびAR-V7遺伝子の共通部分配列に対するsiRNAを用いた場合に、標的遺伝子が従来法よりも効率よくノックダウンされることをRT-qPCRにより確認できた（論文投稿中）。
    また、ペプチド医薬のモデルとして、アポトーシス誘導ペプチドを細胞選択的に細胞質に送達させるために、膜透過促進ペプチドをLDL受容体結合ペプチドとともにアポトーシス誘導ペプチドに融合したタンパク質を大腸菌で大量発現・精製し、ヒト培養細胞に添加したところ、LDL受容体発現細胞選択的な細胞生存率の減少とアポトーシス誘導によるカスパーゼの切断を確認できた（学会発表済み、論文投稿中）。
    さらに、AR-V7に対する抗体医薬をがん細胞選択的に細胞内デリバリーするために、初年度は、様々ながん細胞で高発現しているEGFRを認識する人工ペプチドリガンドおよび小型抗体をmRNAディスプレイ法により試験管内選択した。
    コロナ禍で前半は実験ができない期間があったこともあり、今年度から新たに始めたEGFRを認識する人工ペプチドリガンドおよび小型抗体のmRNAディスプレイ法による試験管内選択については年度内に終えることができなかったが、これまでに利用していたLDL受容体結合ペプチドを利用した細胞選択的DDSについては論文投稿に必要なデータを揃えることができた。また、抗体医薬の細胞質送達については次年度に継続して検討を進めるが、核酸医薬とペプチド医薬についてはモデル系で細胞質送達を確認することができたことから、全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。
    前年度に引き続き、がん細胞表面マーカーとして、様々ながん細胞で高発現しているEGFRやHER2を認識するpH応答性の人工ペプチドリガンドまたは小型ドメイン抗体をmRNAディスプレイ法により試験管内選択する。創出したEGFR／HER2結合ペプチドリガンド／抗体、および、ヒトSyncytin1由来膜透過促進ペプチドを核移行配列とともにAR-V7に対する小型ドメイン抗体に融合したタンパク質を大腸菌で大量発現・精製する。これを前立腺がん由来LNCaP細胞または22Rv1細胞の培地に添加したとき、細胞質および核内に取り込まれ、ARおよびAR-V7の転写活性を阻害することを、AR転写調節領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したレポータージーンアッセイにより確認する。さらに、制がん活性評価のために、22Rv1細胞またはLNCaP細胞にジヒドロテストステロンを添加したときに誘導されるPSAの発現をRT-qPCRで評価する。
    また、独自のヒトSyncytin1由来ペプチドの膜透過促進活性の向上に資するために変異解析を行い、機能に重要なアミノ酸を特定する。具体的には、部位特異的変異を導入した膜透過促進ペプチドを、上記受容体結合ペプチドリガンド／抗体とともに蛍光タンパク質に融合したタンパク質を大腸菌で大量発現・精製し、受容体発現ヒト培養細胞に添加したときの細胞内取り込みの変化を共焦点蛍光顕微鏡で観察する。

  • Development of a two-step molecular targeted therapy to eliminate gastric cancer stem cells and progenitor cells

    2020.04
    -
    2023.03

    Grants-in-Aid for Scientific Research, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), Research grant, Coinvestigator(s)

    　View Summary

    研究代表者らは、ヒト胃癌組織 で、アクチン重合制御蛋白質CAPZA1の過剰発現細胞が、CD44v9陽性癌幹細胞の前駆細胞となることを報告し、CAPZA1の機能制御がCD44v9陽性胃癌幹細胞の発生阻害に繋がることを示した。本研究は、CD44v9陽性癌幹細胞の発生を阻害する分子標的型CAPZA1高親和性ハイブリッドペプチド／抗体と、癌部で既に発生しているCD44v9 陽性癌幹細胞の選択的排除能を有する分子標的型複合ナノ微粒子を創出する。設計・開発された分子標的バイオ医薬は、ヒト胃癌オルガノイド由来mucosoidを用いて機能評価し、癌幹細胞標的療法として創薬応用する。
    胃オルガノイド由来幹細胞駆動型上皮細胞モデルMucosoidを用いた解析では、酪酸刺激にて、胃上皮細胞のCAPZA1発現は顕著に亢進し、H. pylori感染により、CAPZA1過剰発現細胞依存的にCagAが蓄積していくことが、Westernblotting並びに共焦点レーザー顕微鏡解析による免疫染色法により明らかになった。また、mRNAディスプレイ技術を用いて、CAPZA1を分子標的した蛋白質相互作用阻害ペプチドの開発とスクリーニングを行い、CD44v9陽性細胞の発生制御技術の開発を行っている。CAPZA1にビーズ固定用のSBPタグを融合したCAPZA1-SBP蛋白質を大腸菌で大量発現・精製し、AGS細胞抽出液に含まれるLRP1-ICDとの結合を確認することができた。mRNAディスプレイ技術によるCAPZA1結合ペプチドのセレクション探索と並行して、まず野生型LRP1-ICDに膜透過促進ペプチドS19-TATとeGFPを融合したタンパク質を大腸菌で調製した。調製されたeGFP-LRP1(ICD)-S19-TAT融合蛋白質をAGS細胞に添加すると、膜透過促進ペプチドS19の機能によりLRP1-ICDの細胞内移行が促進した。また、CD44v9を特異的に標的するために、CD44v9陽性細胞に特異的な多糖ナノ粒子による遺伝子のデリバリーシステムの開発を行った。異なる組成の多糖ナノ粒子での検討を行うことで、ルシフェラーゼ遺伝子(pLuc)／キトサン／ヒアルロン酸の三元複合体では、CD44v9陽性細胞に特異的な遺伝子の細胞内導入、微小管依存的な核への輸送、および顕著な遺伝子発現活性が得られた。この成果を基盤に、自殺遺伝子(pTK)含有多糖ナノ粒子を用いてCD44v9陽性細胞に対する抗腫瘍効果を検討している。
    本研究では、CAPZA1過剰発現細胞、およびCD44v9陽性癌幹細胞を標的とした次世代分子標的バイオ医薬を開発し、「癌幹細胞/前駆細胞選択的二段階駆逐型新規癌治療戦略」の確立を目的としている。令和2年度の研究成果により、胃内共生細菌由来代謝物依存的なCAPZA1過剰発現を介したCD44v9陽性細胞の発生機構が胃オルガノイドを用いたモデルで明確化され、その細胞の標的技術として、mRNAディスプレイ法とキトサン/ヒアルロン酸(HA)で構成したナノ粒子への自殺遺伝子のパッケージング法の開発が順調に進んでいる。今後、これらの標的技術の精度の向上と、標的化の実践の確認のために、胃オルガノイドモデルを用いた機能評価が必要となるが、ここまでの研究開発により標的技術の開発はおおむね順調に進んでいる。
    令和2年度の成果により、mRNAディスプレイ法を用いたCAPZA1過剰発現細胞の標的技術開発では、CAPZA1にビーズ固定用のSBPタグを融合したCAPZA1-SBP蛋白質を大腸菌で大量発現・精製し、AGS細胞抽出液に含まれるLRP1-ICDとの結合を確認することができたので、今後、CAPZA1-SBPをベイトとしたmRNAディスプレイ法を用いて、CAPZA1に結合するペプチドまたは小型抗体のセレクションを行う。また、調製されたeGFP-LRP1(ICD)-S19-TAT融合蛋白質をAGS細胞に添加すると、膜透過促進ペプチドS19の機能によりLRP1-ICDの細胞内移行が促進したが、過剰なLRP1-ICDの細胞内移行により細胞死が誘導され、LRP1-ICDの細胞内移行量の調節技術が必要になることが示唆されたため、CAPZA1過剰発現細胞特異的にLRP1-ICDを送達させることを目的に、CAPZA1過剰発現特異的な細胞表層受容体の探索・同定をAGS培養細胞とMucosoidモデルを用いて実施する予定である。さらに、ルシフェラーゼ遺伝子(pLuc)／キトサン／ヒアルロン酸の三元複合体糖ナノ粒子では、CD44v9陽性細胞に特異的な遺伝子の細胞内導入、微小管依存的な核への輸送、および顕著な遺伝子発現活性が得られたため、今後、この糖ナノ粒子内へ自殺遺伝子(pTK)をパッケージングし、CD44v9陽性細胞特異的な抗腫瘍効果をMucosoidモデルにて検討する。

  • 新規の膜透過促進ペプチドを利用した安全かつ効率的なゲノム編集技術の開発

    2019.10
    -
    2020.09

    科学技術振興機構　A-STEP 機能検証フェーズ, Research grant, Principal investigator

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Intellectual Property Rights, etc. 【 Display / hide 】

  • 融合タンパク質又は複合タンパク質，細胞内送達用担体，部分ペプチド，細胞膜透過促進剤，DNA，及びベクター

    Date applied： PCT/JP2016/066455  2015.06 

    Date issued： 6864364 

    Date registered： 2021.04

    Patent, Joint

  • 物質と蛋白質との間の相互作用の検出方法

    Date applied： 2001-239175  2001.08 

    Date issued： 3706942  2004.11

    Patent, Joint

  • C末端修飾タンパク質の製造とその利用方法

    Date applied： 2000-373105  2000.11 

    Date issued： 3750020  2005.12

    Patent, Joint

  • タンパク質-ＤＮＡ連結分子及びその利用

    Date applied： 2000-244061  2000.08 

    Date announced： 2001-128690  2001.05 

    Date issued： 04122694 

    Date registered： 2008.05

    Patent, Joint

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Courses Taught 【 Display / hide 】

  • ADVANCED LABORATORY COURSE IN BIOSCIENCES AND INFORMATICS B

    2023

  • ADVANCED LABORATORY COURSE IN BIOSCIENCES AND INFORMATICS A

    2023

  • ADVANCED TOPICS IN EVOLUTIONARY BIOLOGY

    2023

  • TOPICS IN BIOSCIENCES AND INFORMATICS 1

    2023

  • SEMINAR IN BIOSCIENCES AND INFORMATICS

    2023

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Courses Previously Taught 【 Display / hide 】

  • 微生物学

    Keio University

    2015.04
    -
    2016.03
    , 

    Spring Semester, Lecture

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Memberships in Academic Societies 【 Display / hide 】

  • 日本生物工学会, 

    2014
    -
    Present

  • 日本DDS学会, 

    2014
    -
    Present

  • 細胞を創る研究会, 

    2013
    -
    Present

  • 日本癌学会, 

    2010
    -
    Present

  • 日本分子生物学会, 

    1994
    -
    Present

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Committee Experiences 【 Display / hide 】

  • 2018.01
    -
    2021.12

    JB編集委員会 編集委員 (Associate Editor), 日本生化学会

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