慶應義塾研究者情報データベース

経歴 【 表示 ／ 非表示 】

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• 2013年

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  2017年

  群馬大学

• 2017年

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  2018年

  佐々木研究所

• 2018年

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  2019年

  長崎大学

• 2019年

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  2022年

  名古屋大学

• 2022年

  群馬大学

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研究分野 【 表示 ／ 非表示 】

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• ライフサイエンス / 分子生物学 （放射線影響）

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• 53BP1

• BRCA1

• DNA修復

• DSB修復

• DSB修復経路選択性

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論文 【 表示 ／ 非表示 】

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• MeCP2 deficiency leads to the γH2AX nano foci expansion after ionizing radiation.

  Okumura H, Hayashi R, Unami D, Isono M, Yamauchi M, Otsuka K, Kato Y, Oike T, Uchihara Y, Shibata A

  DNA repair 145   103790 2025年01月

  ISSN  15687864

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  DNA double-strand breaks (DSBs) trigger the recruitment of repair protein and promote signal transduction through posttranslational modifications such as phosphorylation. After DSB induction, ataxia telangiectasia mutated (ATM) phosphorylates H2AX on chromatin surrounds the mega-base pairs proximal to the DSBs. Advanced super-resolution microscopic technology has demonstrated the formation of γH2AX nano foci as a unit of nano domain comprised of multiple nucleosomes. The formation of γH2AX nano foci could be potentially affected by pre-existing chromatin structure prior to DSB induction; however, it remains unclear whether chromatin status around DSBs influences the formation of γH2AX nano foci. In this study, to investigate γH2AX nano foci formation in the context of chromatin relaxation, γH2AX nano foci were examined following the depletion of MeCP2, which is a factor promoting chromatin condensation. Remarkably, by using super-resolution imaging analysis, we found that the volume of γH2AX nano foci cluster in MeCP2-depleted cells was significantly greater than that in control cells, both 5 and 30 min after ionizing radiation (IR). Corresponding to the increased volume size, the number of γH2AX nano foci per cluster was greater than that in control cells, while the distance of each nano focus within foci clusters remained unchanged. These findings suggest that relaxed chromatin condition by MeCP2 depletion facilitates faster and more extensive γH2AX nano foci formation after IR. Collectively, our super-resolution analysis suggests that the chromatin status surrounding DSBs influences the expansion of γH2AX nano foci formation, thus, potentially influencing the DSB repair and signaling.

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• Exacerbated Inflammatory Gene Expression After Impaired G2/M-Checkpoint Arrest in Fibroblasts Derived From a Patient Exhibiting Severe Adverse Effects.

  Oike T, Okuda K, Haruna S, Shibata A, Hayashi R, Isono M, Tateno K, Kubo N, Uchiyama A, Motegi SI, Ohno T, Uchihara Y, Kato Y, Shibata A

  Advances in radiation oncology 9 （ 8 ） 101530 2024年08月

  ISSN  2452-1094

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  Purpose: Recent radiation therapy (RT), such as intensity modulated radiation therapy and particle RT, has improved the concentration of the radiation field targeting tumors. However, severe adverse effects still occur, possibly due to genetic factors in patients. We aimed to investigate the mechanism of exacerbated inflammation during RT. Methods and Materials: Dermal fibroblasts derived from a patient with severe inflammatory adverse effects during RT were compared with 2 normal human dermal fibroblasts. Micronuclei formation, G2/M-checkpoint arrest, DNA damage signaling and repair, and inflammatory gene expression were comprehensively examined. Results: We found greater micronuclei formation in radiation-sensitive fibroblasts (RS-Fs) after ionizing radiation (IR). RS-Fs exhibited premature G2/M-checkpoint release after IR, which triggers micronuclei formation because RS-Fs undergo mitosis with unrepaired DNA double-strand breaks (DSBs). Additionally, we found that DSB end-resection and activation of the ATR-Chk1 pathway were impaired in RS-Fs after IR. Consistent with the increase in the formation of micronuclei, which can deliver cytosolic nucleic acids resulting in an innate immune response, the expression of genes associated with inflammatory responses was highly upregulated in RS-Fs after IR. Conclusions: Although this is a single case of RT-dependent adverse effect, our findings suggest that impaired G2/M-checkpoint arrest due to the lack of DSB end-resection and activation of the ATR-Chk1 pathway causes exacerbated inflammation during RT; therefore, genes involved in G2/M-checkpoint arrest may be a predictive marker for unexpected inflammatory responses in RT.

  • Access to Document (DOI)

• Inhibition of intracellular ATP synthesis impairs the recruitment of homologous recombination factors after ionizing radiation.

  Hayashi R, Okumura H, Isono M, Yamauchi M, Unami D, Lusi RT, Yamamoto M, Kato Y, Uchihara Y, Shibata A

  Journal of radiation research 65 （ 3 ） 263 - 271 2024年05月

  ISSN  0449-3060

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  Ionizing radiation (IR)-induced double-strand breaks (DSBs) are primarily repaired by non-homologous end joining or homologous recombination (HR) in human cells. DSB repair requires adenosine-5′-triphosphate (ATP) for protein kinase activities in the multiple steps of DSB repair, such as DNA ligation, chromatin remodeling, and DNA damage signaling via protein kinase and ATPase activities. To investigate whether low ATP culture conditions affect the recruitment of repair proteins at DSB sites, IR-induced foci were examined in the presence of ATP synthesis inhibitors. We found that p53 binding protein 1 foci formation was modestly reduced under low ATP conditions after IR, although phosphorylated histone H2AX and mediator of DNA damage checkpoint 1 foci formation were not impaired. Next, we examined the foci formation of breast cancer susceptibility gene I (BRCA1), replication protein A (RPA) and radiation 51 (RAD51), which are HR factors, in G2 phase cells following IR. Interestingly, BRCA1 and RPA foci in the G2 phase were significantly reduced under low ATP conditions compared to that under normal culture conditions. Notably, RAD51 foci were drastically impaired under low ATP conditions. These results suggest that HR does not effectively progress under low ATP conditions; in particular, ATP shortages impair downstream steps in HR, such as RAD51 loading. Taken together, these results suggest that the maintenance of cellular ATP levels is critical for DNA damage response and HR progression after IR.

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• Characterization of the signal transduction cascade for inflammatory gene expression in fibroblasts with ATM-ATR deficiencies after Ionizing radiation.

  Haruna S, Okuda K, Shibata A, Isono M, Tateno K, Sato H, Oike T, Uchihara Y, Kato Y, Shibata A

  Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology 194   110198 2024年05月

  ISSN  0167-8140

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  Background and purpose: Ionizing radiation (IR) induces DNA double-strand breaks (DSBs), leading to micronuclei formation, which has emerged as a key mediator of inflammatory responses after IR. This study aimed to investigate the signaling cascade in inflammatory gene expression using fibroblasts harboring DNA damage response deficiency after exposure to IR. Materials and methods: Micronuclei formation was examined in human dermal fibroblasts derived from patients with deficiencies in ATM, ATR, MRE11, XLF, Artemis, or BRCA2 after IR. RNA-sequencing analysis was performed to assess gene expression, pathway mapping, and the balance of transcriptional activity using the transcription factor–based downstream gene expression mapping (TDEM) method developed in this study. Results: Deficiencies in ATM, ATR, or MRE11 led to increased micronuclei formation after IR compared to normal cells. RNA-seq analysis revealed significant upregulation of inflammatory expression in cells deficient in ATM, ATR, or MRE11 following IR. Pathway mapping analysis identified the upregulation of RIG-I, MDA-5, IRF7, IL6, and interferon stimulated gene expression after IR. These changes were pronounced in cells deficient in ATM, ATR, or MRE11. TDEM analysis suggested the differential activation of STAT1/3–pathway between ATM and ATR deficiency. Conclusion: Enhanced micronuclei formation upon ATM, ATR, or MRE11 deficiency activated the cGAS/STING, RIG-I-MDA-5-IRF7-IL6 pathway, resulting in its downstream interferon stimulated gene expression following exposure to IR. Our study provides comprehensive information regarding the status of inflammation-related gene expression under DSB repair deficiency after IR. The generated dataset may be useful in developing functional biomarkers to accurately identify patients sensitive to radiotherapy.

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• Ubiquitination of DNA Damage-Stalled RNAPII Promotes Transcription-Coupled Repair.

  Yuka Nakazawa, Yuichiro Hara, Yasuyoshi Oka, Okiru Komine, Diana van den Heuvel, Chaowan Guo, Yasukazu Daigaku, Mayu Isono, Yuxi He, Mayuko Shimada, Kana Kato, Nan Jia, Satoru Hashimoto, Yuko Kotani, Yuka Miyoshi, Miyako Tanaka, Akira Sobue, Norisato Mitsutake, Takayoshi Suganami, Akio Masuda, Kinji Ohno, Shinichiro Nakada, Tomoji Mashimo, Koji Yamanaka, Martijn S Luijsterburg, Tomoo Ogi

  Cell 180 （ 6 ） 1228 - 1244 2020年03月

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  Transcription-coupled nucleotide excision repair (TC-NER) is initiated by the stalling of elongating RNA polymerase II (RNAPIIo) at DNA lesions. The ubiquitination of RNAPIIo in response to DNA damage is an evolutionarily conserved event, but its function in mammals is unknown. Here, we identified a single DNA damage-induced ubiquitination site in RNAPII at RPB1-K1268, which regulates transcription recovery and DNA damage resistance. Mechanistically, RPB1-K1268 ubiquitination stimulates the association of the core-TFIIH complex with stalled RNAPIIo through a transfer mechanism that also involves UVSSA-K414 ubiquitination. We developed a strand-specific ChIP-seq method, which revealed RPB1-K1268 ubiquitination is important for repair and the resolution of transcriptional bottlenecks at DNA lesions. Finally, RPB1-K1268R knockin mice displayed a short life-span, premature aging, and neurodegeneration. Our results reveal RNAPII ubiquitination provides a two-tier protection mechanism by activating TC-NER and, in parallel, the processing of DNA damage-stalled RNAPIIo, which together prevent prolonged transcription arrest and protect against neurodegeneration.

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競争的研究費の研究課題 【 表示 ／ 非表示 】

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• 放射線照射により惹起される炎症性サイトカイン存在下でのDNA修復能の検討

  2024年04月

  -

  2028年03月

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 磯野 真由, 基盤研究(C), 補助金,  研究代表者

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  炎症は古くから知られる特徴的な放射線障害の一つである。近年、放射線照射後に多くの炎症性遺伝子の発現が高まること、炎症性サイトカイン存在下ではDNA二本鎖切断（DSB）が蓄積することが示された。そこで申請者は、既報のデータベースを用いて遺伝子発現解析を行った結果、炎症性サイトカイン存在下ではDSB修復の遺伝子発現が低下することを見出した。つまり、炎症性サイトカイン存在下では放射線誘発DSBに対するDNA修復能が低下し、遺伝子異常や生存率の低下が引き起こされる可能性がある。本研究では、放射線誘発炎症性微小環境因子が、その後のDSB修復能に影響を与えるのかを検証し、さらにその分子機構の解明に迫る。

• RNAポリメラーゼIIのDNA二本鎖切断修復機構への関与の解明

  2020年04月

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  2023年03月

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 磯野 真由, 若手研究, 未設定

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  転写領域におけるRNAポリメラーゼ(Pol II)の停滞やRNA:DNAハイブリッド構造の蓄積はゲノムの不安定性を誘発し、発がんや難治性神経変性疾患につながることを示唆する報告がある。ゲノムの不安定化はDNA損傷応答・修復機構に障害があると誘発される。また、Pol IIが内因性のDNA二本鎖切断(DSB)の誘発に寄与することは示されている。しかしながら、転写領域のDSB修復の分子機構の詳細は明らかにされていない。Pol IIのDSB修復経路への関与と役割について明らかにすることによって、上記で示すような病態解明の一助になると考えている。
  カンプトテシンによってDSBが誘発されている状況下で、Pol II抗体による免疫沈降法を用いたウェスタンブロットを行い、DSB修復関連タンパクの抗体を用いたスクリーニングから、いくつかのタンパクがPol IIと相互作用することを確認した。その中の相同組換え修復関連タンパクの一つ(名前は伏せる)に注目して実験を行い、SUMO認識型ユビキチンE3リガーゼ(名前は伏せる)の欠損によって、Pol IIとの相互作用が見られなくなることを確認した。
  今後は、Pol IIとDSB修復関連タンパクの相互作用やSUMO認識型ユビキチンリガーゼがDSB修復にどのような役割を持つのか詳細を検討したいと考えている。

• 放射線誘発DNA二本鎖切断での53BP1 repositioningの分子機構

  2017年04月

  -

  2020年03月

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 磯野 真由, 若手研究(B), 未設定

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  53BP1は、DNA二本鎖切断 (DSB)誘発時にはATM活性に依存してDSB部位に集積し、非相同末端結合 (NHEJ)を促進して相同組換え (HR)を抑制することが知られている。本研究では、G2期のHRが進行しているDSBで53BP1の集積塊 (foci)を検出し、その集積の制御や意義を明らかにすることを目的とした。HR進行中の53BP1 foci数は、ATM阻害剤を添加しても未添加との違いは見られなかったが、ATR阻害剤の添加によって減少した。このことから、HR修復時のDSB部位で見られる53BP1 fociの維持には、ATM活性ではなくATR活性が関与していることが示唆された。

• 超高解像度顕微鏡を用いた重粒子線誘発DNAクラスター損傷修復の可視化

  2015年04月

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  2017年03月

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 磯野 真由, 柴田 淳史, 挑戦的萌芽研究, 未設定

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  重粒子線照射は局所集中的に多様なDNA損傷(クラスター損傷)を誘発すると考えられているが、未だ細胞レベルでクラスター損傷の可視化は出来ていない。本研究では次世代3D超高解像度顕微鏡を用いて重粒子線誘発DNA損傷の可視化を試みた。重粒子線誘発DNA二本鎖切断(DSB)の可視化には、DSB末端の一本鎖DNA領域に集積するRPA fociをマーカーとして用いた。我々は重粒子線が通過した軌道上に非常に近接して複数個のRPA fociが存在することを見出した。このような近接した複数のDSBの生成は、重粒子線特異的であり、X線と比較した際の高い染色体異常や細胞致死性を導く要因となることが示唆された。

• 放射線脳壊死の発症機序解明における神経幹細胞および分化細胞の関与についての研究

  2013年08月

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  2015年03月

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 磯野 真由, 研究活動スタート支援, 未設定

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  本研究では放射線照射後のネクローシス及びアポトーシスの誘導について、神経幹細胞と脳腫瘍細胞を比較した。神経幹細胞または脳腫瘍細胞に対してX線照射し、Acridine Orange及びEthidium Bromideの二重染色によってネクローシスとアポトーシス細胞の割合を測定した。その結果、神経幹細胞はアポトーシスによる細胞死の亢進が認められた。一方で脳腫瘍細胞はアポトーシスに対して抵抗性であった。また、神経幹細胞ではp53のリン酸化の亢進が認められた。さらに、バイスタンダー効果について解析したところ、神経幹細胞におけるX線誘発のアポトーシスの多くは直接効果によるという予備的な結果が得られた。

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