競争的研究費の研究課題 - 塚田　祐基

動物の探索行動に対する情報物理学

2022年04月

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2024年03月

日本学術振興会, 科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型), 塚田 祐基, 新学術領域研究(研究領域提案型), 研究代表者

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線虫は温度勾配上に置かれると、それまでに餌を得ていた温度へ向かって探索しながら移動する（温度走性）。このときトラッキングシステムで温度勾配上を探索している個体の行動を計測すると同時に、蛍光画像で非侵襲に特定の神経活動を計測する。
計測には申請者が開発したトラッキング顕微鏡システムを用い、行動中の線虫を自動的に顕微鏡視野内に捕捉し、神経活動と行動の同時計測を行う。これらのデータを情報量と神経活動の情報伝達に注目して定量的に解析する。また探索行動戦略について数理モデルを構築し、シミュレーション解析を行う。さらにシミュレーション予測に基づいて光遺伝学を用いた検証実験を行う。

神経情報伝達におけるシナプス数と位置の役割

2020年04月

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2023年03月

日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 塚田 祐基, 基盤研究(C), 研究代表者

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本研究では、神経回路に対して光を用いたマイクロ-ナノメートル単位の時空間操作を行い、その影響を神経活動と個体行動の計測として定量することで、神経回路の構造が回路全体の機能においてもつ役割の理解を進めることを目的とする。この目的達成のため、本年度は主に以下の項目について進捗があった。異所局在の解消、インテグラントの作成、蛍光3色イメージングの実現、パルスを用いた光毒性の軽減、AIY介在神 経細胞の応答ばらつき解消。まず異所局在の解消については、光遺伝学によるシナプスレベルの神経活動制御に対してminiSOGを用いた方法を進めているが、miniSOGを標的神経細胞へ発現させる際、シナプスへの局在と共に、細胞体のERらしき場所にも発現する問題があった。そのためER移行シグナルを付加させたタンパク質を新たに作成し、標的神経細胞のプロモーターと共に導入したところ、この異所局在が解消された。これにより光によるERへの不必要なダメージが低減されることが期待できる。これらのタンパク質を発現した線虫系統は、染色体外に導入遺伝子を保持するものであったため、ゲノムに挿入させたインテグラント系統の作成することで、遺伝子発現の安定化と系統のばらつき抑制を実現した。さらにこれまでGCaMPとRCaMPで神経活動を計測していた線虫系統に、633nmの長波長で励起される蛍光タンパクを導入し、シナプスをラベルした。この3色イメージングにより、シナプス位置を計測しながらレーザー手術を行うことが実現できた。また、連続光ではなくパルス光を使うことによる光毒性の低減、さらには実験操作の工夫により、ばらつきの多かったAIY介在神経細胞の応答を均一化することに成功した。

少数細胞の分裂異常が個体機能を喪失させる原理の解明

2019年10月

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2024年03月

日本学術振興会, 科学研究費助成事業 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B)), 上原 亮太, 塚田 祐基, 松尾 和哉, 塚田 祐基, 松尾 和哉, 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B)), 研究分担者

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本研究では、生体内で起こる少数細胞の分裂制御エラーが、個体発生や機能に及ぼす影響を定量的に明らかにして、細胞分裂異常に起因する病態形成のメカニズムを理解することを目的としている。2020年度は、前年度に作成に成功した光応答性CenpE阻害剤をゼブラフィッシュ初期胚に導入し、同化合物を用いた生体局所分裂障害の導入の実現性を明らかにすることを主な目標とした。化合物が水溶性に比較的乏しいため、投薬条件の特定に、当初予定以上に多くの検証を要した。しかし、最終的に最適処理条件を見出すことに成功し、受精直後からの投薬によって、受精後３時間程度の発生胚から再現性よく、照射光波長依存的に細胞分裂期の染色体運動をon/off制御することに成功した（固定胚を用いた蛍光抗体法および、蛍光ヒストン安定発現系統を用いた生細胞観察により確認した）。さらに、異なる光照射条件下で、同化合物処理胚の発生、生存性を追跡したところ、CenpE活性を阻害する光照射条件下（可視光照射）では、受精後１０時間前後で重篤な発生障害をともなってすべての胚が死滅するのに対し、CenpE活性阻害を解除する照射条件下（UV光照射）においては、すべての胚が、無処理コントロールと差異なく正常な発生を行うことができることを見出した。このことから、同化合物を用いた分裂阻害が、CenpE阻害条件では生体機能を阻害するのに十分に高効率な分裂阻害能をもつ一方で、阻害解除条件では優れた低侵襲性を保っていることが明らかになった。一方で、より多様な細胞分裂の空間制御を実現するために、光学異性化特性の異なる数種の分裂期モータータンパク質の光応答性阻害剤の作成に着手し、そのうちの一部について、培養細胞モデルにおいて、高い時空間分解能で細胞分裂進行をon/off制御できることを見出した。

染色体倍加に伴う慢性的な中心体異常の発生原理と細胞不均一性への寄与

2019年04月

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2022年03月

日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(B), 上原 亮太, 塚田 祐基, 塚田 祐基, 基盤研究(B), 研究分担者

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本研究では、申請者が最近発見したヒト体細胞における染色体倍加現象に伴う中心体の増大、機能亢進および複製亢進現象の発生原理と、それらが細胞形質変化に及ぼす影響を理解することを目的としている。2019年度はまず、染色体倍加細胞で見られる中心体増大の実態を理解するために、種々の染色体マーカーや微小管形成能評価アッセイを用いて、染色体倍加に伴い、細胞分裂期の中心体に具体的にどのような変化が起こっているかを調べた。ヒト大腸がん由来HCT116細胞の二倍体コントロールおよび染色体倍加細胞株の比較によって、染色体倍加に伴い中心体周辺物質の主要構成因子の中心体への集積がいずれも有意に増大し、微小管重合能も倍増していることを定量的に突き止めた。さらに、染色体倍加細胞における中心体増大の生理・病理的意義を検証するために、人為的に中心体増大現象を抑制することができる染色体倍加HCT116細胞株の確立を試みた。具体的には、中心体周辺物質の集積の足場を提供する中心体構成遺伝子の発現量を、オーキシンデグロンシステムでコンディショナルに半減できる細胞株を作成し、実際にオーキシン添加によって染色体倍加細胞における中心体サイズ、中心体周辺物質の集積、微小管形成能を、二倍体レベルにまで低減させることに成功した。興味深いことに、この人為的に中心体増大を抑制した染色体倍加細胞では、著しい細胞増殖能の低下が見られた。さらにライブイメージング解析により、この中心体増大抑制細胞株では、細胞死の頻度が増加し、他の細胞分裂擾乱処理への感受性が著しく増加することを見出した。このことから、新奇中心体増大現象は、染色体倍加細胞において、その生存性や増殖の堅牢性を担保する役割を果たす可能性が示唆された。

複数のカメラを用いた顕微鏡オートフォーカスアルゴリズムの開発

2017年04月

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2018年03月

公益財団法人堀科学芸術振興財団, 第2部研究助成, 塚田祐基, 研究代表者

介在神経回路における情報変換原理の解明

2016年04月

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2019年03月

日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(A), 森 郁恵, 中野 俊詩, 塚田 祐基, 基盤研究(A), 連携研究者

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動物が生存のため効果的に行なっている行動モードの切り替えと維持の制御メカニズムに関して、介在神経細胞に注目し、網羅的な解析を行った。行動と神経活動の時系列計測、またそれらに対する数理解析により、これまで分かっていなかった探索や移動行動における行動要素の構成が明らかとなり、それに関わる機能的な神経回路も明らかとなった。また行動モード依存的な神経活動の状態を明らかにし、神経活動への摂動方法を確立することで機能的な神経回路地図を同定し、その解析方法も確立した。

ROS産生酵素による寿命延長機構の解明

2015年04月

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2017年03月

日本学術振興会, 科学研究費助成事業 挑戦的萌芽研究, 森 郁恵, 中野 俊詩, 塚田 祐基, 中野 俊詩, 塚田 祐基, 挑戦的萌芽研究, 連携研究者

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活性酸素（ROS）は、生命現象において重要な機能を担っている。特に、ミトコンドリアから放出される低レベルのROS（mtROS）は、寿命を延長させることが知られている。本研究では、線虫の解析により、生体膜で作用するDual oxidase(BLI-3)によって生成されたROSが、peroxidase（MLT-7）によって分解されることによって、低レベルのROSが産生されることで、線虫の寿命を延長させることを見出した。また、Redox co-factorであるpyrroloquinoline quinone (PQQ)は、生体膜依存的BLI-3を活性化させることも突き止めた。

高速トラッキング顕微鏡を用いた神経微小領域の活動計測

2014年04月

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2017年03月

文部科学省, 挑戦的萌芽, 塚田祐基, 森 郁恵, 中野 俊詩, 橋本 浩一, 挑戦的萌芽研究, 研究代表者

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顕微鏡観察下で自由に行動する微小生物を自動追尾するトラッキングシステムを開発し、温度勾配上を自由に行動する線虫を高倍率の対物レンズ下で追尾することに成功した。特定の神経細胞に蛍光カルシウムプローブを発現させ、このシステムで測定することで、自由行動下での非侵襲神経活動計測を実現した。さらにこのトラッキングシステムから得られる動画データを解析するため、画像解析プログラムを開発した。これら開発したツールを用い神経活動計測と温度勾配を探索しているときの行動要素を比較することで、介在神経細胞の活動が探索行動にどのように関わっているかを定量した。

光遺伝学による神経回路と行動の解析

2012年04月

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2016年03月

日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(A), 森 郁恵, 塚田 祐基, 中野 俊詩, 塚田 祐基, 中野 俊詩, 基盤研究(A), 連携研究者

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線虫の温度に対する学習行動をモデル実験系とし、新しい光遺伝学ツールの導入と評価を行うことで、これまで解析が難しかった、行動中の神経回路における活動動態とそれによる行動制御メカニズムの一端を明らかにした。特に、線虫の特性を活かして厳密な行動実験を実現する実験系を構築し、神経活動や行動を同時計測している最中に光遺伝学の利点を活用することで、神経活動を制御した。これらの解析により、AFD感覚神経細胞における感覚シグナルと行動の関係や、AIYおよびRIA介在神経細胞で観測される確率的な神経活動の機能解明を進めた。

探索行動における情報処理機構の解明

2012年04月

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2014年03月

文部科学省, 科学研究費補助金(若手研究(B)), 塚田祐基, 若手研究(B), 研究代表者

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動物の「探索行動」は環境からの情報を高度に処理し、行動を戦略的に制御することで成り立っているが、神経回路による探索行動についての情報処理機構はほとんど分かっていない。神経回路の接続地図が完全に明らかになっている線虫C.elegansの温度走性をモデルとし、探索行動中の特定の神経細胞活動をカルシウムイメージングで取得、数理解析を行うことで、神経回路による探索行動の制御機構の一端を明らかにした。

高速トラッキングによる局所神経回路の機能動態

2011年04月

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2013年03月

文部科学省, 科学研究費補助金(新学術領域研究(研究領域提案型)), 塚田祐基, 新学術領域研究(研究領域提案型), 研究代表者

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本研究では、神経突起などの微細部位でのみカルシウムシグナルが検知できる神経細胞を対象に、個体が自由に動く状況でカルシウムシグナル検出をする手法を開発し、行動中の神経活動と行動を定量的に測定することで、個々の神経活動と行動の関係を直接明らかにすることを目的とした。特に、神経回路における情報処理機構を知る上で鍵となる、線虫のAIY介在神経細胞に注目し、記憶や学習を調べる実験系である温度走性行動中の神経活動記録を目指した。
24年度はこれまでの成果に基づき高速トラッキングシステムの改良を行い、特に自動焦点合わせの精度と安定性を向上させ、それらを効果的に利用する応用実験方法を確立した。動く対象物を顕微鏡で観察する場合、高倍率になると対象を捕捉するための高速な制御と焦点合わせが問題となる。高速な制御はこれまの成果により実現できていたが、焦点合わせについては実現されていなかった。分岐させた顕微鏡光路と３台の高速カメラを使って、異なる焦点面から同時に画像取得を行い、その画像を使って焦点制御を行うシステムを開発した。さらに、AIY介在神経細胞で高感度のカルシウムプローブGEM-GECOを発現させ、蛍光イメージングを行った。動く対象におけるカルシウムイメージングでは動きによるノイズの影響を排除するため、蛍光プローブの感度の高さが非常に重要である。高感度のカルシウムプローブを実用化することで信頼性の高いカルシウムイメージングデータを取得できるようになった。これらの開発した機器、試料を用い、温度勾配を寒天プレート上に形成する装置と組み合わせることで、温度勾配上を自由に行動している線虫を高倍率で追尾しながら蛍光イメージングすることに成功した。このように、機能や動作機構を調べることが難しい介在神経細胞に対して信頼できる実験系を設立することができた。
24年度が最終年度であるため、記入しない。
24年度が最終年度であるため、記入しない。