Research Projects of Competitive Funds, etc. - Tsukada, Kosuke

Interpretation of regulatory system of fetal cardiovascular development with re-evaluation of substance transport characteristics in fetal circulation

2020.04

-

2022.03

Grants-in-Aid for Scientific Research, Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering), No Setting

　View Summary

母親の胎内は生後に比べて非常に酸素濃度が低いが、母親と胎児をつなぐ胎児循環（胎盤や血液中で酸素を運ぶヘモグロビン分子）は効率的に酸素を運ぶためのシステムとして捉えられることが多い。しかし胎児のエネルギー消費は大きくなく、過剰な酸素は細胞分裂時に有害にさえなり得る。本研究では胎児循環を胎児細胞の為に最適な低酸素環境を維持し、体を構成するための基質（アミノ酸や脂肪酸）を選択的に運搬する循環システムであると捉え、研究対象として出生後すぐに細胞分裂を止める心筋細胞を扱う。何億年もかけ培ってきた細胞制御システムを分子・細胞・臓器レベルで解明することは、再生医療にも役立つ情報の取得に繋がると期待される。
胎生期の栄養環境が心臓に及ぼす影響を明らかにするため、活発に分裂を繰り返して原始心臓を形成する胎児心筋細胞とアミノ酸環境の関係をラットの培養心筋細胞で検討した。ラットを用いて、胎生20日目、出生後２日目、５日目もしくは６日目、８週齢において、血中および心筋組織中の各種アミノ酸濃度を測定したところ、血中アミノ酸濃度は、Lys，Met，Phe，Trpなどが心筋分裂が盛んな胎生20日目で濃度が高く、出生後には減少した。心筋組織中のアミノ酸濃度は、出生前後で血中ほどの大きな変化はみられなかったが、Leu，Lys，Phe，Valは、出生後にやや減少していた。これらの結果より、ラット胎児の培養心筋細胞を用い、細胞増殖マーカー（Ki67）を指標として心筋細胞分裂能とアミノ酸の関係を検討した。まず胎生20日目の心筋細胞において、単独のアミノ酸での培養を行なった時の分裂能を検討し、分裂能に促進効果のありそうなアミノ酸を探索した。次いで、胎生17日目と胎生20日目の心筋細胞において、心筋分裂に影響のありそうな複数のアミノ酸を除去して培養を行ない、分裂能を検討した。単独アミノ酸培養では、Cys，Gly，His，Lys，Valでの培養が、単独でも、通常培地と同程度の細胞増殖マーカーの陽性率を示した。アミノ酸除去実験では、胎生17日目の心筋細胞においては一度に10種のアミノ酸を除去すると陽性率は有意に減少したが、その他の組み合わせ（３～９種）でははっきりとした陽性率の減少はみられなかった。胎生20日目の心筋細胞では、10種のアミノ酸の除去で陽性率が有意に減少し、Cys・Gly・Ser、His・Ile・Trpの３種、Gly・Lys・Tyr・Valの４種、必須アミノ酸９種の除去で、有意ではなかったが、陽性率が減少する傾向にあった。
胎盤における選択的物質輸送の具体例としてアミノ酸に着目し、成体と胎児血液におけるアミノ酸濃度の違いを確認出来た。心筋細胞培養実験では、アミノ酸の種類によって心筋分裂能の維持に影響の強いものもあったが、特に影響の強いアミノ酸を認めなかった。胎児循環の酸素環境が心臓形成に及ぼす影響に関しては、ポルフィリン燐光を用いた生体微小循環酸素計測システムを構築して臍帯動静脈の酸素分圧を同時に計測しながら母体側の酸素環境を変化させて胎児循環の酸素運搬特性が大量の酸素輸送を目的とするものではなく、成体と比べて著しく低い酸素濃度を維持するための緩衝機構であることを証明する予定であったが、社会的要因から共同実験の進捗が滞り課題が残されたため。
胎児循環のアミノ酸選択的輸送と心筋細胞分裂に関する研究に関しては、アミノ酸配合の様々な組み合わせと心筋細胞分裂能の関係を検証していく。また、胎生期の低栄養環境が心臓に及ぼす影響を解析するため、妊娠15日目から妊娠21日目まで、母ラットに50％摂食制限を施して胎生期低栄養ラットを作成し、自由摂食の母ラットから生まれた仔と出生前後（胎生20日目、出生後1日目、14日目、21日目、30週齢）において、体重、心重量の測定や、心筋組織における心機能関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子の発現を比較する。また、胎生期低栄養ラット４週齢において、モノクロタリン（Mct）30mg/kgを皮下投与して肺高血圧症を発症させて、心エコーによる心機能評価や血中ANP濃度測定を行う。また、ポルフィリン燐光を用いた生体微小循環酸素計測システムの構築を進め、胎児循環の酸素環境と胎児心臓形成に関する情報を分子・細胞・個体循環システムでベルで統合的に検討する。

単一細胞の超解像酸素分圧イメージング

2019.04

-

2022.03

MEXT,JSPS, Grant-in-Aid for Scientific Research, Grant-in-Aid for Scientific Research (C), Principal investigator

Development of the new technology of fertility preservation for the AYA cancer patients

2017.04

-

2020.03

Grants-in-Aid for Scientific Research, Nao Suzuki, Grant-in-Aid for Scientific Research (B), No Setting

　View Summary

In recent years, the number of childhood and AYA (Adolescent and Young Adult is the age from 15 to 39 years old) generation cancer survivors who have overcome cancer has been increasing with the progress of multidisciplinary treatment in cancer treatment. On the other hand, cancer treatment for childhood and AYA (CAYA) cancer patients may cause gonadal dysfunction or loss of fertility depending on the treatment method. In Japan, fertility-preserving therapy before the start of cancer treatment for some female CAYA cancer patients has recently been introduced. Ovarian tissue cryopreservation, the only fertility-preserving therapy for children and adolescents with cancer, requires long-term storage for more than 10 years. As a result of this research, we succeeded in developing a new storage system that ensures the safety against human error in the long-term storage system and obtained the results showing the safety of antifreeze for long-term storage.

皮膚や臓器に貼付できるフレキシブル酸素イメージングフィルム

2016.04

-

Present

日本学術振興会, Grants-in-Aid for Scientific Research, Tsukada Kosuke, Grant-in-Aid for Scientific Research (C), Principal investigator

　View Summary

We have developed a new oxygen sensor device that can be attached to the surface of curved skin and organs. The oxygen sensor consisted of three layers, a sensing layer containing an oxygen sensitive dye, an excitation light source layer, and a light receiving layer. By encapsulating oxygen sensitive dye in polystyrene nanoparticles, we succeeded in improving the measurement accuracy. We adopted electrochemiluminescence as the excitation light source and determined its electrical condition. The calibration experiment showed the possibility of measuring oxygen concentration with high sensitivity. In the future, by arranging the elements at high density, application to two-dimensional imaging of oxygen concentration is expected.

近赤外光による新規ワクチンアジュバントのインフルエンザ集団予防接種への適用を目的とするポータブルレーザー医療機器の創出

2016.04

-

Present

AMED, 橋渡し研究加速ネットワークプログラム, Principal investigator

組織低酸素イメージングセンサの開発と造影剤投与不要な初期がん検出への実用

2015.04

-

2016.03

中谷医工計測技術振興財団, No Setting

近赤外レーザによる物理的免疫アジュバントの確立：生体の新たな光感受機構の探求

2014.04

-

2015.03

日本学術振興会, Principal investigator

転移性腫瘍の早期検出を目的とした無侵襲光計測法の開発と医療への展開

2011.04

-

2012.03

医科学応用研究財団, Research grant, No Setting

近赤外ラマン分光法による生体内ガス分子動態の可視化と腫瘍検出技術への応用

2010.04

-

2012.03

日本学術振興会, No Setting