村野　健作 (ムラノ　ケンサク)

Murano, Kensaku

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所属（所属キャンパス）

医学部 分子生物学教室 分子生物学教室 （信濃町）

職名

専任講師

HP
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研究分野 【 表示 ／ 非表示 】

  • ゲノム生物学

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著書 【 表示 ／ 非表示 】

  • タンパク質発現プロトコール

    村野 健作, 羊土社, 2010年

    担当範囲: 哺乳動物細胞

  • Recent DNA Structure, Chromatin and Gene Expression

    村野 健作, Transworld Research Network, 2006年

    担当範囲: Molecular and physiological roles of histone chaperones

  • クロマチンと遺伝子機能制御

    村野 健作, シュプリンガー・フェアラーク東京, 2003年

    担当範囲: ヒトモデルとしてのマウスとウイルスからみたクロマチン制御

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論文 【 表示 ／ 非表示 】

  • Template Activating Factor-I α Regulates Retroviral Silencing during Reprogramming

    Bui P., Nishimura K., Seminario Mondejar G., Kumar A., Aizawa S., Murano K., Nagata K., Hayashi Y., Fukuda A., Onuma Y., Ito Y., Nakanishi M., Hisatake K.

    Cell Reports （Cell Reports)  29 （ 7 ） 1909 - 1922.e5 2019年11月

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    © 2019 The Author(s) Reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs) is accompanied by dramatic changes in epigenetic programs, including silencing of endogenous and exogenous retroviruses. Here, we utilized replication-defective and persistent Sendai virus (SeVdp)-based vectors to monitor retroviral silencing during reprogramming. We observed that retroviral silencing occurred at an early reprogramming stage without a requirement for KLF4 or the YY1-binding site in the retroviral genome. Insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) enabled us to isolate factors assembled on the silenced provirus, including components of inhibitor of histone acetyltransferase (INHAT), which includes the SET/TAF-I oncoprotein. Knockdown of SET/TAF-I in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) diminished retroviral silencing during reprogramming, and overexpression of template activating factor-I α (TAF-Iα), a SET/TAF-I isoform predominant in embryonic stem cells (ESCs), reinforced retroviral silencing by an SeVdp-based vector that is otherwise defective in retroviral silencing. Our results indicate an important role for TAF-Iα in retroviral silencing during reprogramming.

  • Essential roles of Windei and nuclear monoubiquitination of Eggless/SETDB1 in transposon silencing.

    Osumi K, Sato K, Murano K, Siomi H, Siomi MC

    EMBO reports    e48296 2019年10月

    共著, 査読有り,  ISSN  1469-221X

  • Nuclear RNA export factor variant initiates piRNA-guided co-transcriptional silencing

    Murano K., Iwasaki Y., Ishizu H., Mashiko A., Shibuya A., Kondo S., Adachi S., Suzuki S., Saito K., Natsume T., Siomi M., Siomi H.

    EMBO Journal （EMBO Journal)  38 （ 17 ） e102870 2019年09月

    共著, 査読有り,  ISSN  02614189

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    © 2019 The Authors The PIWI-interacting RNA (piRNA) pathway preserves genomic integrity by repressing transposable elements (TEs) in animal germ cells. Among PIWI-clade proteins in Drosophila, Piwi transcriptionally silences its targets through interactions with cofactors, including Panoramix (Panx) and forms heterochromatin characterized by H3K9me3 and H1. Here, we identified Nxf2, a nuclear RNA export factor (NXF) variant, as a protein that forms complexes with Piwi, Panx, and p15. Panx–Nxf2–P15 complex formation is necessary in the silencing by stabilizing protein levels of Nxf2 and Panx. Notably, ectopic targeting of Nxf2 initiates co-transcriptional repression of the target reporter in a manner independent of H3K9me3 marks or H1. However, continuous silencing requires HP1a and H1. In addition, Nxf2 directly interacts with target TE transcripts in a Piwi-dependent manner. These findings suggest a model in which the Panx–Nxf2–P15 complex enforces the association of Piwi with target transcripts to trigger co-transcriptional repression, prior to heterochromatin formation in the nuclear piRNA pathway. Our results provide an unexpected connection between an NXF variant and small RNA-mediated co-transcriptional silencing.

  • Tbx6 Induces Nascent Mesoderm from Pluripotent Stem Cells and Temporally Controls Cardiac versus Somite Lineage Diversification

    Sadahiro T., Isomi M., Muraoka N., Kojima H., Haginiwa S., Kurotsu S., Tamura F., Tani H., Tohyama S., Fujita J., Miyoshi H., Kawamura Y., Goshima N., Iwasaki Y., Murano K., Saito K., Oda M., Andersen P., Kwon C., Uosaki H., Nishizono H., Fukuda K., Ieda M.

    Cell Stem Cell （Cell Stem Cell)  23 （ 3 ） 382 - 395.e5 2018年09月

    共著, 査読有り,  ISSN  19345909

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    © 2018 Elsevier Inc. The mesoderm arises from pluripotent epiblasts and differentiates into multiple lineages; however, the underlying molecular mechanisms are unclear. Tbx6 is enriched in the paraxial mesoderm and is implicated in somite formation, but its function in other mesoderms remains elusive. Here, using direct reprogramming-based screening, single-cell RNA-seq in mouse embryos, and directed cardiac differentiation in pluripotent stem cells (PSCs), we demonstrated that Tbx6 induces nascent mesoderm from PSCs and determines cardiovascular and somite lineage specification via its temporal expression. Tbx6 knockout in mouse PSCs using CRISPR/Cas9 technology inhibited mesoderm and cardiovascular differentiation, whereas transient Tbx6 expression induced mesoderm and cardiovascular specification from mouse and human PSCs via direct upregulation of Mesp1, repression of Sox2, and activation of BMP/Nodal/Wnt signaling. Notably, prolonged Tbx6 expression suppressed cardiac differentiation and induced somite lineages, including skeletal muscle and chondrocytes. Thus, Tbx6 is critical for mesoderm induction and subsequent lineage diversification. Sadahiro et al. show that Tbx6 is critical for mesoderm induction and subsequent lineage diversification from pluripotent stem cells (PSCs). Transient Tbx6 expression induced nascent mesoderm and cardiovascular lineages from mouse and human PSCs, whereas prolonged Tbx6 expression suppressed cardiac differentiation and induced somite lineages, including skeletal muscle and chondrocytes.

  • Profiling open chromatin structure in the ovarian somatic cells using ATAC-seq

    Murano K., Iwasaki Y., Siomi H.

    Methods in Molecular Biology （Methods in Molecular Biology)  1680   165 - 177 2018年

    共著, 査読有り,  ISSN  10643745

    　概要を見る

    © 2018, Springer Science+Business Media LLC. The assay for transposase-accessible chromatin using sequencing (ATAC-seq) was recently established as a method to profile open chromatin, which overcomes the sample size limitations of the alternative methods DNase/MNase-seq. To investigate the role of Piwi in heterochromatin formation around transposable element loci, we have used ATAC-seq to examine chromatin accessibility at target transposable elements in a Drosophila cultured cell line, ovarian somatic cells (OSCs). In this chapter, we describe our method to profile open chromatin structure in OSCs using ATAC-seq.

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KOARA（リポジトリ）収録論文等 【 表示 ／ 非表示 】

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競争的資金等の研究課題 【 表示 ／ 非表示 】

  • 非コードRNAによる生殖細胞ゲノムの恒常性維持機構

    2017年04月
    -
    2020年03月

    文部科学省・日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 村野　健作, 基盤研究(C), 補助金,  代表

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    生殖細胞系列で転移と増殖を繰り返すレトロトランスポゾンは、生命の次世代継承にとって脅威である。非コード小分子RNA（piRNA）とPIWIタンパク質の複合体は、配列情報と相補的なレトロトランスポゾンを抑制し、ゲノムの恒常性を維持している。本研究ではPIWI-piRNA経路の解析を通じて、宿主が非自己であるレトロトランスポゾンを寛容・承認し、「ゲノムの恒常性を維持しつつ進化していく過程」の理解を目的としている。生殖細胞に発現するPIWI-piRNA経路の機能は、倫理的な問題からヒトでの解析は困難であり、マウスを使った場合でも試料の少なさから生化学的解析が遅れている。そこで、本研究では機能的PIWI-piRNA経路を保持するヒトまたはマウス培養細胞株の確立を目指している。Fred Gage博士の研究チームは、霊長類であるヒト、ボノボ、チンパンジーのiPS細胞を構築し、RNA-seqによる遺伝子発現パターンを比較した。その結果、ヒトiPS細胞では、他の二つの霊長類iPS細胞に比べて、PIWI遺伝子の一つPIWIL2の発現量が高いことが明らかとなった。我々もヒトiPS細胞内でPIWIL2のmRNAを検出できた。以上の結果から、ヒトiPS細胞は我々の求める「機能的PIWI-piRNA経路を保持する培養細胞株」の第一候補となっている。しかしながら、この報告を含めてこれまでにヒトPIWIL2-piRNA複合体の実体は検出されていない。そこでヒトPIWIL2に対するモノクローナル抗体を作製した。残念ながらヒト精巣抽出液を用いたウェスタンブロッティング法ではヒトPIWIL2の発現を確認できるものの、ヒトiPS細胞でヒトPIWIL2の発現は検出できなかった。現在、ヒト精巣腫瘍由来細胞株に着目してヒトPIWIL2-piRNA複合体を発現する細胞株の探索を続けている
    現在までに、ヒトPIWIL2に対するモノクローナル抗体の作製に成功している。ヒトiPS細胞ではmRNAレベルでヒトPIWIL2の発現は確認できたものの、タンパク質としては発現していないことが明らかとなった。したがって我々の求める機能的PIWI-piRNA経路を保持する培養細胞株の候補から、ヒトiPS細胞は外れることになった。一方で、ヒト精巣抽出液由来のヒトPIWIL2タンパク質の検出ができていることから、我々の求める機能的PIWI-piRNA経路を保持する培養細胞株の探索の準備は整った。
    これまでにmRNAレベルにおいてPIWIL2を発現する培養細胞株が多数報告されている。それら細胞株を取り寄せて、構築したヒトPIWIL2に対するモノクローナル抗体を用いて評価を行う。また、免疫沈降法により結合している小分子RNAの有無を評価することにより、我々の求める機能的PIWI-piRNA経路を保持する培養細胞株の探索を続ける。また、培養細胞の改変により求める細胞株の構築を試みる。転写因子A-MYBはマウスにおいてpiRNA前駆体をはじめ、PIWI-piRNA経路に関わる遺伝子（Piwi1, Piwil2, MitoPld, Mov10l1, Vasa等）の転写反応を正に制御しているが明らかとなっている。したがって転写因子A-MYBの強制発現により機能的PIWI-piRNA経路を保持する細胞株が得られると考えている。候補となっている細胞株にA-MYBの強制発現を予定している。

  • 新規高感度レポーター系を用いたrRNA遺伝子の種特異的転写開始機構の解析

    2013年06月
    -
    2015年03月

    筑波大学, 村野 健作, 新学術領域研究(研究領域提案型)

    　研究概要を見る

    rRNA遺伝子の転写反応は厳格な種特異性を示す。ヒトrRNA遺伝子はマウス細胞内で転写されず、またマウスrRNA遺伝子はヒト細胞内で転写されない。この種特異的転写は、マルチサブユニット因子SL1（ヒト）およびTIF-IB（マウス）に起因する。SL1/TIF-IBはrRNA遺伝子のコアプロモーターを認識し、転写開始点を規定する。rRNA遺伝子の転写開始反応を支配する複合体であるにもかかわらず、これまで構成因子によるSL1/TIF-IB活性の再構成はなされてこなかった。我々は、マウス細胞内においてヒトrRNA遺伝子転写を再構成し、マウス細胞内におけるSL1活性にはヒト由来の4種類のTAFI（TBP-associate factor I）が必要かつ十分であることを示してきた。一方で、マウス由来の4種類のTAFIを発現させても、ヒト細胞内においてマウスrRNA遺伝子転写を再構成することができなかった。試験管内転写反応系においても、HeLa細胞核抽出液はマウスF9細胞核抽出液を用いたマウスrRNA遺伝子転写を阻害した。また、マウスF9細胞核抽出液はHeLa細胞核抽出液を用いたヒトrRNA遺伝子の転写反応を阻害することが明らかとなった。そこで、SL1とTIF-IBはそれぞれマウスとヒトのrRNA遺伝子転写に干渉する可能性を検討した。マウス細胞内においてSL1構成因子の過剰発現は、マウスrRNA遺伝子の転写反応を強く抑制した。また、siRNAを用いてSL1構成因子の発現抑制を試みたところ、HeLa細胞内においてTIF-IB構成因子の過剰発現によりマウスrRNA遺伝子の転写に成功した。以上の結果から、HeLa細胞内におけるマウスrRNA遺伝子転写では、SL1がTIF-IB活性に干渉することが明らかとなった。
    26年度が最終年度であるため、記入しない。
    26年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 精子核クロマチンのダイナミクス

    2012年04月
    -
    2015年03月

    筑波大学, 村野 健作, 永田 恭介, 基盤研究(C)

    　研究概要を見る

    精子形成の過程で、精子核は遺伝情報を次世代へと伝えるために特化した高度に凝集したクロマチン構造をとる。我々はアデノウイルスの感染サイクルと精子形成・受精過程の生物学的類似性に着目した。アデノウイルスクロマチンをリモデリングする活性を持つヒストンシャペロンTAF-Iは精子核クロマチンを膨潤する活性を持つ。本研究の結果、TAF-Iは細胞の分化にともなう細胞増殖に重要であり、またマウス個体の発生に必須であることが明らかとなった。

  • ヒストンシャペロンTAF-Iによる初期胚細胞核ダイナミクスの制御機構

    2011年
    -
    2012年

    筑波大学, 村野 健作, 加藤 広介, 特定領域研究

    　研究概要を見る

    ピストンとDNAの複合体であるクロマチン構造は、ゲノムDNAをコンパクトに収納しつつ遺伝子の発現制御に関わっている。ヒストンシイペロンはクロマチン構造の動的変動に関わる因子の一つである。多数のコアヒストンバリアント特異的なヒストンシャペロンが同定され機能解析が進んでいる。ところが、哺乳類細胞におけるリンカーヒストンH1シャペロンの実体はほとんど明らかでなかった。そこで我々はリンカーヒストンシャペロンの同定とマウス発生過程における機能解析を進めてきた。Flagタグを付加したピストンH1を恒常的に発現するHeLa細胞を樹立し、細胞核抽出液画分より精製したH1相互作用タンパク質について、質量分析による網羅的な同定を試みた。これにより、Template Activating Factor(TAF-I)が新規のヒストンH1結合タンパク質として同定された。TAF-1は試験管内でヒストンシャペロン活性を持ち、細胞内でヒストンH1の核内動態に関与することを見出した。次に生体内におけるTAF-1の機能を解析するため、TAF-1ノックアウト(KO)マウスを作製した。TAF-I KOマウスは、野生型に比べ胎生8.25日目から徐々に成長が遅れ、未熟な血管形成と重度な貧血を示し、胎生12.5日目までに致死であった。TAF-I KOマウスで観察された成長の遅延を詳細に解析するため、TAF-I KO ES細胞を構築した。TAF-I KO ES細胞は細胞分化を誘導すると、野生型に比べ顕著に細胞増殖速度が低下した。またヒストンシャペロン活性を欠失したTAF-1変異体の発現では、その細胞増殖速度の低下を回復することができなかった。以上の結果から、TAF-1はヒストンシャペロンとして発生分化過程の細胞増殖速度を維持し、正常な組織の形態および機能の形成に関与すると考えられる。

  • 発生分化過程におけるヒストンシャペロンTAF-lの機能

    2009年
    -
    2010年

    筑波大学, 村野 健作, 若手研究(B)

    　研究概要を見る

    生物の発生分化は時間的、空間的制御を受けた遺伝子の発現パターンにより決定される。遺伝子発現のパターンは転写因子のネットワークにより構築され、ヒストンを始めとするクロマチン構造によって固定化されると考えられている。しかし、発生分化過程のクロマチン構造の動的変動の機構と役割については多くが不明である。我々はヒストンシャペロンであるTemplate Activating Factor(TAF)-Iに着目し、発生過程におけるクロマチン構造の果たす役割を検討することとした。そこでTAF-Iノックアウト(KO)マウスを作製したところ、重度な貧血と未熟な血管形成が見られ、胎生12.5日目までに致死であった。10.5日胚におけるTAF-Iの発現パターンを間接蛍光抗体法により検討したところ、TAF-Iはすべての組織で発現していた。TAF-I KO胚では野生型胚に比べ胎生8.25日目から徐々に発生が遅れていることが観察された。TAF-I KO胚の発生の遅れは一様ではなく、10日目から遅れ始める個体も観察され、様々であることが明らかとなった。10.5日胚を用いた網羅的遺伝子発現解析により、TAF-I KO胚では低酸素に応答する遺伝子群および解糖系に関連する遺伝子群の発現量が増加していることが明らかとなった。以上の結果からTAF-I KOマウスは血液・血管の発生異常に伴い、低酸素状態からエネルギー不足となり死に至ると考えられる。現在、TAF-I KO ES細胞の構築に成功し、血液・血管の形成を始めとする細胞分化におけるTAF-Iの機能を解析中である。

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担当授業科目 【 表示 ／ 非表示 】

  • 分子生物学Ⅱ

    2020年度

  • 分子生物学Ⅱ

    2019年度

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