競争的研究費の研究課題 - 古川　亮平

イトマキヒトデの変態誘導機構の解明

2023年04月

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2026年03月

科学研究費助成事業, 古川 亮平, 田口 瑞姫, 基盤研究(C), 未設定

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変態現象にバクテリアが関与する動物種は多く、バクテリア刺激をキューとした変態制御の分子基盤を明らかにすることは、生態系の理解や生態発生学の発展に有用な知見となる。イトマキヒトデは、浮遊生活を送る幼生期から底生生活を送る成体に変態する際、固着基質表面に存在するバイオフィルムを必要とする。最近、この変態の開始にはバクテリア刺激によるレチノイン酸経路の活性化が必要であることが示唆された。そこで本研究では、イトマキヒトデの変態過程を網羅したトランスクリプトームデータを用いて、バクテリア刺激の直下で発現上昇する遺伝子群から、レチノイン酸経路を活性化する変態誘導シグナルを同定する。

ヒトデ幼生の自己・非自己認識に関わる種特異的糖鎖の探索

2020年04月

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2023年03月

科学研究費助成事業, 古川亮平, 若手研究, 補助金,  研究代表者

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棘皮動物イトマキヒトデの幼生において唯一の免疫細胞である間充織細胞は、生きた同種細胞であれば免疫応答を生じない「missing-species（種の喪失）認識」によって自己と非自己を識別していると予想されている。この認識システムを可能にするには、細胞表面に何らかの種特異的な分子が必要である。本研究では、この種特異的分子の単離・同定を目指し、無脊椎動物がどのように「自己」を認識しているのかという問題に挑む。
申請者の先行研究により、棘皮動物イトマキヒトデの幼生において唯一の免疫細胞である間充織細胞が、同種異個体のみならず本来幼生の体内に存在しない精 子であっても、生きた同種の細胞であれば免疫応答を生じない「missing-species(種の喪失)認識」によって自己と非自己を識別している可能性が示唆されている。この認識システムを可能にするには、自己マーカーに相当する種特異的な分子の存在が必要であるが、予備データからこの分子が何らかの糖鎖であることが示唆されていた。本研究は、イトマキヒトデの精子を材料に、幼生のmissing-species認識を可能にする種特異的な糖鎖を探索し、その単離・同定を目指すものである。
今年度はまず、各種レクチンを用いたスクリーニングの再現性の確認を行った。昨年度と同様、各種レクチンを結合させた生きた精子を幼生体内に顕微注射し、 間充織細胞による貪食作用の有無を調べた。昨年度はConA結合精子に対する貪食作用の増強が認められたが、コントロールと比較して統計的に有意な差は得られなかった。同様に、その他のレクチンで染色した精子を用いた場合においても貪食作用が認められるケースもあった。従って、レクチン染色時の操作による精子の生存率の低下によって、死細胞に対する免疫応答の活性化として検出された可能性が排除できない。一方、各種糖鎖切断酵素で処理した精子の生存率も高いとは言えず、昨年度に引き続いて条件検討は難航している。
レクチン染色、酵素処理共に、精子の生存率を低下させない条件検討が難航していることによる。また、世界的な新型コロナウイルス感染症の流行により、多くの消耗品や試薬類の大幅な納品遅れも頻出し、イトマキヒトデの生殖シーズン中に十分な実験を行うことも困難であった。
本研究は、幼生のmissing-species認識を可能にする種特異的な糖鎖を探索するものであり、研究計画では簡便且つ大量に得ることができる精子を材料とした計画で進めている。しかしこれまでのところ、レクチン染色や酵素処理を施した精子を幼生体内に顕微注射するまでの間に、精子の生存性が低下する可能性が浮かび上がってきている。本研究で探索している種特異的な糖鎖は、それをブロックすることで幼生の免疫細胞による貪食作用を亢進するような物質であるため、材料としての精子は必須ではない。そこで今後は、材料を精子だけでなく、免疫細胞自体も材料として、レクチン染色や酵素処理が貪食作用に及ぼす影響を調べていく予定である。また、処理済みの精子の顕微注射ではなく、レクチンや酵素と精子を同時に顕微注射することも試みる。
さらに、今年度入手できなかった糖鎖補足ビーズを用いて、酵素処理によって精子から遊離させた糖鎖を結合したビーズを作製し、これを材料とした解析も行う予定である。

海洋プランクトン幼生の成長：摂餌の消化・吸収と栄養素の伝播・受容

2018年04月

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2021年03月

科学研究費補助金(文部科学省・日本学術振興会）, 金子 洋之, 基盤研究(C), 補助金,  研究分担者

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本研究の目的は、棘皮動物ヒトデ幼生の消化システムと神経システムに焦点を当てながら、成長に寄与する消化・吸収ならびに栄養素の伝搬・受容を理解することにある。本年度もコロナ禍による研究制限の状態が続いたが、複数の重要な研究データを得ることができた。その一部を用いて、学会発表を行った。
消化システムと神経システムの解明ポイントとなる幼生サイズの増加に着目した結果、胚期の時間依存的な発生様式と異なり、幼生サイズに依存した成長が進行して変態可能なステージに移行することを明らかにできた。この過程で摂餌は必要であり、（１）餌がない状態では変態可能になる前段階で形態形成が停止すること、（２）摂餌には感覚神経細胞が重要な働きをしていることも判明した。
一方、幼生成長の基盤をなす上皮細胞数の確保において、上皮細胞増殖の主因となる間充織細胞の膜型アスタチン属メタロプロテアーゼ（MC５分子）は、TGFbの潜在型から活性型への変換だけでなく、上皮細胞の生存自体をも担保している可能性を見出した。このとき、上皮細胞の生存に対するデフォルトの表現型は、細胞断片化によるアポトーシス細胞死である証拠も得られた。最終年では、既得したデータ解析や論文の補助的データ取得を含みつつ、研究の完成を目指す。
コロナウイルスの感染変動に祟られるように、計画していた複数の実験計画の遂行を諦めざるを得なかった。一方、この様な状況の中、基本に立ち戻るべく行った新たな実験から、本研究の目的である幼生成長の理解を導く複数の有意義なデータが得られた（それらの一部をまとめて学会発表にまで至っている：以下の（１））。また、昨年来進めてきた研究においても、論文完成へ向けて新たなデータの取得ができた（以下の（２））。
（１）受精後の初期胚から得た分離割球の胚期と幼生期における成長特性
時間依存的に進行する胚期の発生と異なり、摂餌を行うビピンナリア幼生期以降はサイズ依存的な成長段階のシフトが生じることが判明した。投餌必要性の検討により、ビピンナリア幼生期の前半は母性栄養で成長が可能であるのに対し、後半以降は餌が必須条件になることが示唆された。温度感受性の感覚神経細胞が発現しているTRPAチャネル機能をモルフォリノで抑制したところ、胚期の発生には何ら影響はなかったが、ビピンナリア幼生の摂餌量は減少し、成長速度が遅延した。
（２）アスタチン族メタロプロアーゼMC5分子によるアポトーシス細胞死の回避
最近、間充織細胞のMC5分子はTGFbを活性化させて上皮増殖を誘起することを証明できた。　これに加え、MC5分子は上皮細胞の生存にも関与している可能性も見出した。モルフォリノオリゴ(MO)でMC5分子の発現を抑制させたサンプルでは、アポトーシス細胞死が生じている現場として上皮細胞の断片化が、電子顕微鏡下で検出され、上記の可能性が支持された（TGFbが上皮細胞の生存に関与してないことは、TGFb-MOサンプルで確認した）。また、ペプチド性のアポトーシス阻害剤とMC5-MOの同時注射により、MC5-MOサンプルに特徴的な著しい細胞数の減少が緩和されるという強力な補助データも得られた。
コロナ禍の完全な収束が早々には認められないこと、ならびに現在までの進捗状況を鑑みて、先ずは前項7に記載した内容に焦点を絞り、取得してきた実験データの解析を鋭意に進め、本年度中に複数の論文として完成させることを優先する。論文作成でのレフェリーとのやり取りにおいて割愛せざるを得ないデータが出た場合、また本研究を計画するにあたり貯めおいていたデータ（クラスリン分子による胃における消化）なども対象に、紀要などの予備研究報告書も考慮にいれ、可能な限り実験データを塩漬けにしないことに留意する。
一方、投稿論文の採択を目指すにあたり、レフェリーとのやり取りの中で要求される可能性がある補助実験を先に進める。具体的には、前項7の後半部に記述したMC5分子のアポトーシス回避機能において、そのメカニズムとして作動していることが推測される細胞外マトリックス成分であるコラーゲンタイプIVのMC5-MOサンプルにおける存在状態、MC5分子の発現局所性、MC5-MOの濃度依存的影響の解析となる。

DNAメチル化・トランスクリプトーム・血漿メタボロームの３層オミックス解析を用いた電気加熱式たばこの喫煙・受動喫煙の県境影響に関する疫学研究

2018年04月

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2020年03月

日本医療研究開発機構, 循環器疾患・糖尿病等生活習慣病対策実用化研究事業, 武林 亨, その他,  研究分担者

ヒトデ幼生のマクロファージ遊走阻止因子による炎症制御機構の解明

2017年04月

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2020年03月

科学研究費補助金(文部科学省・日本学術振興会）, 古川 亮平, 若手研究(B), 補助金,  研究代表者

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本研究では、系統進化的に最も原始的なサイトカインの一つと考えられているマクロファージ遊走阻止因子（MIF）に着目し、ヒトデ幼生の免疫細胞が発現する２種のMIF（ApMIF1およびApMIF2）に対する受容体と、その下流に存在する細胞内シグナルを探索した。2種のリコンビナントMIFで処理したヒトデ幼生の免疫細胞におけるRNA-seq解析の結果、MIFの下流ではMAPKおよびPI3K/Aktシグナル経路が存在することが示唆された。さらに、受容体候補として2種のGタンパク質共役型と、２種の受容体型チロシンキナーゼが得られた。
哺乳類においてMIFは様々な疾患への関与が推測されており、その生理機能の全容解明が待たれている。解決すべき最も重要な課題は、進化的に保存された受容体の同定である。本研究において、同定までは至っていないが、４種類の受容体候補が得られている。今後詳細な機能解析を通して受容体を明らかにできると期待している。一方、MIFの下流に存在するシグナル経路に関しては、哺乳類での知見と一致する経路が得られており、MIFの作用の進化的保存性が推測される。近い将来、受容体の同定とこれらのシグナル経路の関連性が明らかになれば、幅広い動物種における炎症制御機構の共通原理を提示できると考えられる。

変態を経て変化する棘皮動物人での自然免疫系の分子基盤を探る

2009年04月

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2012年03月

科学研究費補助金(文部科学省・日本学術振興会）, 補助金,  研究代表者